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公開番号2025033947
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-13
出願番号2023140013
出願日2023-08-30
発明の名称筋炎治療薬のスクリーニング方法
出願人株式会社Stratoimmune,日産化学株式会社,国立大学法人東京医科歯科大学
代理人弁理士法人津国
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250306BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】筋炎を治療、予防又は改善するための薬物を提供することを可能にする新規なスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】RasGRP4遺伝子を標的とする核酸化合物をスクリーニングする方法であって、単球細胞又はマクロファージ細胞にRasGRP4遺伝子を標的とする核酸化合物を導入する工程、得られた細胞を培養する工程、及び前記培養物中に存在する単位体積あたりのmRNA量を測定する工程を含む、方法とする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物をスクリーニングする方法であって、
単球細胞又はマクロファージ細胞にＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物を導入する工程、
得られた細胞を培養する工程、及び
前記培養物中に存在する単位体積あたりのｍＲＮＡ量を測定する工程
を含む、方法。
続きを表示（約 600 文字）【請求項２】
前記細胞は、単球細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単球細胞が、ヒト単球性白血病細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト単球性白血病細胞が、ＴＨＰ１細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、マクロファージ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マクロファージ細胞は、マウス骨髄由来又はマウス腹腔由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、マウス単球マクロファージ系細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マウス単球マクロファージ系細胞株が、ＲＡＷ２６４．７又はＪ７７４Ａ．１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記導入する工程は、核酸化合物導入試薬又はエレクトロポレーション法により行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物をスクリーニングする方法であって、
筋炎誘導マウスにＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物を投与する工程、及び
単位体積あたりのｍＲＮＡ量を測定する工程
を含む、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本願は、筋炎治療薬を創出するためのスクリーニング方法に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
多発性筋炎／皮膚筋炎（ｐｏｌｙｍｙｉｏｉｔｉｓ／ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ：ＰＭ／ＤＭ）は、筋肉や皮膚、肺を中心に全身に炎症が生じる自己免疫疾患であり、主に近位筋優位の筋力低下を来たす。ＰＭ／ＤＭでは、間質性肺炎の合併も多く、予後不良となりうる。日本におけるＰＭ／ＤＭの患者数は１７，０００人（２０１０年）であり、有病率は１０万人当たり１３．２人と報告されている（例えば、非特許文献１参照）。その正確な病因は不明であるため、標準治療はグルココルチコイドおよび他の免疫抑制剤を含む非特異的免疫抑制剤の投与が主となっている。
【０００３】
ＲａｓＧＲＰ４（Ｒａｓｇｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ４）は、Ｒａｓを活性化するグアニン交換因子であり、単球、マクロファージ、好中球、肥満細胞などの骨髄球においてその発現が高い。
ＰＭ患者の筋生検サンプルの組織学的解析において、筋細胞におけるＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子の発現量およびＣＤ８陽性Ｔ細胞における細胞障害性因子（パーフォリンやグランザイム）量が増加していること（非特許文献２参照）、ＰＭ患者由来末梢血においてＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンが増殖し、その筋組織への浸潤がみられること（非特許文献３、４、５参照）が報告されている。
ＰＭ／ＤＭ患者由来末梢血単核球でのＲａｓＧＲＰ４発現量は健常人と比較して有意に高いことが報告されている（非特許文献６参照）。
Ｃ蛋白を免疫することで誘導される筋炎マウスの筋組織において、ＣＤ１１ｂ陽性細胞は、単球及びマクロファージを含み、その細胞数はＴ細胞の細胞数と同程度であることが報告されている（非特許文献７参照）。Ｔ細胞は、免疫システムの一部である。Ｔ細胞は、リンパ節や他の二次リンパ器官等において異物（抗原）と反応する。異物（抗原）が抗原提示細胞によって処理された後に、Ｔ細胞は抗原を認識することができる。抗原提示細胞として、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞が知られている。
ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現を阻害する物質としては、ｓｉＲＮＡ（特許文献１、特許文献２、非特許文献８）が報告されている。
なお、ＲａｓＧＲＰ４ｓｉＲＮＡの足関節内投与は、コラーゲン誘導関節炎ラットにおいて、コントロールと比較して有意に足関節炎スコアと足関節径を減少させ、また骨破壊、軟骨破壊も軽減させることが報告されている（非特許文献８参照）。また、ＲａｓＧＲＰ４ノックアウトマウスは、野生型マウスと比較してドデシル硫酸ナトリウム誘導大腸炎を軽減させることも報告されている（非特許文献９参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
特開２０１９－１３１５０２号公報
特開２０２０－０１５６７８号公報
【非特許文献】
【０００５】
Mod Rheumatol. 2014，24(3)，pp 477-80
J Rheumatol. 1996，23(7)，pp 1135-42
J Immunol. 2001，167(7)，pp 4051-8
J Exp Med. 1995，181(5)，pp 1863-8
J Clin Invest. 1993，91(6)，pp 2880-6
Arthritis Res Ther. 2011，13(5)，R154
Arthritis Rheumatol. 2007，56(4)，pp 1304-14
Arthritis Rheumatol. 2015，67(2)，pp 396-407
J Biol Chem. 2012，287(24)，pp 20047-55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既存のＰＭ／ＤＭ治療薬には、副作用や治療抵抗性の出現などの課題がある。したがって筋炎を治療、予防又は改善するための新たな薬物が求められている。
本願の課題は、筋炎を治療、予防又は改善するための薬物を提供することを可能にする新規なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
筋障害においては前述のとおりＣＤ８陽性Ｔ細胞の重要性が示唆されている。
一方、単球およびマクロファージに発現しているＲａｓＧＲＰ４は、抗原特異的なリンパ球の活性化を介した筋障害を誘導している可能性が考えられる。
単球およびマクロファージにおけるＲａｓＧＲＰ４の発現が抑制されると、抗原特異的なリンパ球の活性化を介した筋障害が抑制され、筋炎の治療効果が期待できる。
【０００８】
本発明者らは、ＲａｓＧＲＰ４欠損マウス及び正常マウスに対して筋炎を誘導し、筋炎の重症度や四肢筋力を測定した。その結果、ＲａｓＧＲＰ４欠損マウスでは、正常マウスに比較して、筋炎が軽症化したことが示された。
したがって、ＲａｓＧＲＰ４を阻害する薬物は、筋炎（特には、多発性筋炎／皮膚筋炎）を治療、予防及び／又は改善できることが期待される。
さらに本発明者らは鋭意検討した結果、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子の発現を阻害する薬物をスクリーニングする手法として、単球細胞及び／又はマクロファージ細胞におけるＲａｓＧＲＰ４のｍＲＮＡ量を測定する方法を見出した。また、正常マウスに対して筋炎を誘導してＲａｓＧＲＰ４のｍＲＮＡ量／病変の大きさを示す組織学的スコア／四肢筋力を測定する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下を特徴とするものである。
【０００９】
１．
ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物をスクリーニングする方法であって、
単球細胞又はマクロファージ細胞にＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物を導入する工程、
得られた細胞を培養する工程、及び
前記培養物中に存在する単位体積あたりのｍＲＮＡ量を測定する工程
を含む、方法。
２．
前記細胞は、単球細胞である、１．に記載の方法。
３．
前記単球細胞が、ヒト単球性白血病細胞である、２．に記載の方法。
４．
ヒト単球性白血病細胞が、ＴＨＰ１細胞である、３．に記載の方法。
５．
前記細胞は、マクロファージ細胞である、１．に記載の方法。
６．
前記マクロファージ細胞は、マウス骨髄由来又はマウス腹腔由来である、５．に記載の方法。
７．
前記細胞は、マウス単球マクロファージ系細胞株である、１．に記載の方法。
８．
前記マウス単球マクロファージ系細胞株が、ＲＡＷ２６４．７又はＪ７７４Ａ．１である、７．に記載の方法。
９．
前記導入する工程は、核酸化合物導入試薬又はエレクトロポレーション法により行われる、１．から８．のいずれかに記載の方法。
１０．
ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物をスクリーニングする方法であって、
筋炎誘導マウスにＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物を投与する工程、及び
単位体積あたりのｍＲＮＡ量を測定する工程
を含む、方法。
１１．
正常マウスにブピバカイン又は骨格筋Ｃ蛋白フラグメントを投与することにより筋炎誘導マウスを作製する工程を含む、１０．に記載の方法。
１２．
筋炎を治療、予防及び／又は改善するための化合物をスクリーニングする方法であって、
筋炎誘導マウスに当該化合物を投与する工程、及び
当該マウス四肢筋力を測定する工程、及び／又は病変の大きさを測定する工程
を含む、方法。
１３．
正常マウスにブピバカイン又は骨格筋Ｃ蛋白フラグメントを投与することにより筋炎誘導マウスを作製する工程を含む、１２．に記載の方法。
１４．
前記化合物は、ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物である、方法。
１５．
ＲａｓＧＲＰ４遺伝子を標的とする核酸化合物又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含む、筋炎を治療、予防及び／又は改善するための医薬組成物。
１６．
前記筋炎は、多発性筋炎及び／又は皮膚筋炎である、１５．に記載の医薬組成物。
１７．
前記核酸化合物が、ｓｉＲＮＡである、１５．又は１６．に記載の医薬組成物。
１８．
前記核酸化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、１５．又は１６．に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本願により、筋炎を治療、予防又は改善するための薬物を提供することを可能にする新規なスクリーニング方法を提供することができた。したがって、筋炎を治療、予防及び／又は改善できる医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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