特許ウォッチ

公開番号2025024072
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-19
出願番号2024197415,2021544774
出願日2024-11-12,2019-10-14
発明の名称幹細胞の大規模調製のための三次元培養方法
出願人北京華龕生物科技有限公司
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/00 20060101AFI20250212BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】幹細胞の大規模調製のための三次元(3D)培養方法を提供する。
【解決手段】三次元マイクロキャリア上で細胞を接種するための、三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養方法であって、前記細胞付着培養方法が、(B1)細胞接種:細胞懸濁液と乾燥三次元マイクロキャリアとを混合して、細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを得る工程と、(B2)細胞付着:細胞が三次元マイクロキャリアに付着するように、工程(B1)で得られた細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアをインキュベートする工程と、(B3)細胞培養:工程(B2)での細胞付着後、完全培養培地を添加し、培養を実施する工程と、を含む、細胞付着培養方法である。さらに、三次元マイクロキャリアから細胞を分離するための、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法、および三次元マイクロキャリアに基づく細胞培養方法のセットも提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎｓｉｔｕ継代方法、および三次元マイクロキャリアに基づくｉｎｓｉｔｕ細胞凍結保存方法を含む、三次元マイクロキャリアに基づく細胞培養方法のセットであって；
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は以下の工程：細胞蘇生および培養のために、三次元マイクロキャリア上に解凍後に、凍結保存された細胞または凍結保存された細胞微小組織の細胞懸濁液を接種する工程を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：シードマイクロキャリアを新しいマイクロキャリアに挿入する工程を含み；ここでシードマイクロキャリアは継代される細胞と共に培養されるマイクロキャリアであり；
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎｓｉｔｕ細胞凍結保存方法は、以下の工程：
（Ａ１）細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、細胞含有キャリアを得る工程と；（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞含有キャリアを凍結保存溶液と混合し、極低温貯蔵管に加える工程と；
（Ａ３）工程（Ａ２）で細胞含有キャリアを加えた極低温貯蔵管を冷却し、次いでそれを液体窒素に移し、三次元マイクロキャリア上の細胞のｉｎｓｉｔｕ凍結保存を可能にする工程と、を含む。
続きを表示（約 4,300 文字）【請求項２】
前記方法が三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法、およびマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法をさらに含み、三次元マイクロキャリア上の細胞付着培養の方法は、三次元マイクロキャリア上で細胞を接種するために使用され、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、三次元マイクロキャリアから細胞を分離するために使用され、マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は、マイクロキャリア上で培養された細胞の総数および／または細胞密度の計算を実行するために使用される、請求項１に記載の方法であって；
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は以下の工程：（Ｂ１）細胞接種：細胞懸濁液を乾燥三次元マイクロキャリアと混合して、細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを得る工程と；（Ｂ２）細胞付着：工程（Ｂ１）で得られた細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを、細胞が三次元マイクロキャリアに付着するようにインキュベートする工程と；（Ｂ３）細胞培養：工程（Ｂ２）での細胞付着後、完全培養培地を添加し、培養を実施する工程とを含み；
三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は以下の工程：（Ｃ１）培養細胞に付着した三次元マイクロキャリアを自然沈殿または遠心分離し、上清を除去して細胞を含む三次元マイクロキャリアを得る工程と；（Ｃ２）細胞を含む三次元マイクロキャリアに溶解液を添加し、その中の三次元マイクロキャリアをインキュベートおよび溶解する工程と；（Ｃ３）工程（Ｃ２）において三次元マイクロキャリアを完全に溶解した後、溶解を終了させるために停止液を添加する工程または直接工程（Ｃ４）に進んで溶解を終了させる工程と；（Ｃ４）工程（Ｃ３）において得られた系を遠心分離し、上清を廃棄し、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する工程と、を含み；
マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は以下の工程：（Ｄ１）細胞培養のための所定重量のマイクロキャリアを秤量し、それらをサンプリングチューブに入れ、細胞培養プロセスをシミュレートするために液体を添加し、それらを４～６０℃で０～２４時間浸漬し、次いで、サンプリングチューブ上のマイクロキャリアによって占められる体積に対応するスケールを標準スケールとしてマーキングする工程と；（Ｄ２）マイクロキャリア上で培養された細胞を、次のように、マイクロキャリアの体積を標準スケールにするために、サンプリングチューブを用いて細胞培養系からマイクロキャリアをサンプリングする工程と、を含む。
【請求項３】
前記三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法が、三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法または三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法である請求項１または２に記載の方法であって；
三次元マイクロキャリアに基づく動的細胞蘇生方法は、以下の工程：（Ｅ１）三次元マイクロキャリアを採取し、細胞培養容器に入れ、細胞培養培地を添加し、直ちに次の工程または、放置または撹拌する処理方法で１分間以上処理する工程と；（Ｅ２）凍結保存された細胞又は凍結保存された細胞微小組織を解凍して得た細胞懸濁液を工程（Ｅ１）で調製したマイクロキャリアを含む細胞培養容器に３７℃で接種し、次いで細胞培養培地を添加し、培地に対するマイクロキャリアの比率を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整し、次いで細胞培養容器を攪拌機上に置き、インキュベーター中で攪拌する工程と；（Ｅ３）工程（Ｅ２）の完了後、細胞蘇生が完了するまで細胞を攪拌し続ける工程と、を含み；
三次元マイクロキャリアに基づく静的細胞蘇生方法は、以下の工程：（Ｆ１）静的培養容器およびマイクロキャリアの調製：三次元マイクロキャリアを採取し、細胞培養容器に入れる工程と；（Ｆ２）凍結保存細胞の解凍、接種：凍結保存細胞または凍結保存細胞微小組織を採取し、３７℃で解凍し、次いで工程（Ｆ１）で調製したマイクロキャリアを含む静的培養容器に２０～２４０分間接種する工程と；（Ｆ３）工程（Ｆ２）の完了後、細胞蘇生が完了するまで細胞を培養し続ける工程と、を含む。
【請求項４】
撹拌が一定速度撹拌または可変速度交互撹拌または可変速度周期撹拌であり、撹拌が時計方向の撹拌、反時計方向の撹拌または交互方向での撹拌であり、撹拌時間が０．１～１００時間であり、撹拌速度が１～２００ｒｐｍである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
撹拌が次の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）のとおりである、請求項４に記載の方法：
（ａ）１～４時間放置した後、時計方向に周期的な可変速度で１～２４時間撹拌し、その後、時計方向に９６時間まで一定速度で撹拌する；
（ｂ）周期的な可変速度で時計方向に１～２４時間撹拌した後、９６時間まで時計方向に一定速度で撹拌する；
（ｃ）１～９６時間、一定速度で時計方向に撹拌する。
【請求項６】
工程（Ｅ２）または（Ｆ２）において、マイクロキャリアに対する細胞数の比率が、５～１００×１０
３
細胞／ｍｇマイクロキャリアである、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎｓｉｔｕ継代方法において、前記シードマイクロキャリアは１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有し、前記シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎｓｉｔｕ継代方法が、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎｓｉｔｕ継代方法または三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎｓｉｔｕ継代方法である請求項１～６のいずれか１項に記載の方法であって；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく動的なｉｎｓｉｔｕ継代方法は以下の工程：（Ｇ１）新しいマイクロキャリア懸濁液の調製工程：インペラー内蔵細胞培養フラスコに新しいマイクロキャリアを入れ、細胞培養培地を１～２，０００μＬ：１ｍｇのマイクロキャリアの比で添加し、新しいマイクロキャリア懸濁液を得るために０時間を超えて静置または撹拌する；（Ｇ２）シードマイクロキャリア懸濁液の調製工程：シードマイクロキャリアは１０，０００～１００万細胞／ｍｇマイクロキャリアの細胞密度を有し、シードマイクロキャリアを０．１～５０ｍｇ／ｍＬに細胞培養培地で再懸濁してシードマイクロキャリア懸濁液を得る；（Ｇ３）接種工程：（Ｇ１）で調製した新しいマイクロキャリア懸濁液を含むインペラー内蔵細胞培養フラスコに、（Ｇ２）で調製されたシードマイクロキャリア懸濁液を混合する工程であって、（Ｇ１）で調製された新しいマイクロキャリアに対するシードマイクロキャリアの比は０．０００２～２００ｍｇのシードマイクロキャリア／ｍｇの新しいマイクロキャリアであり、培地に対するマイクロキャリアの比を１ｍｇ：１～１０００μＬに調整するために細胞培養培地を添加し工程、インペラー内蔵細胞培養フラスコを攪拌機上に置き、０～１００時間攪拌するためにインキュベーター中に置く；（Ｇ４）培養工程：攪拌を続け、動的なｉｎｓｉｔｕ継代を完了する、を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づく静的なｉｎｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：（Ｈ１）シードマイクロキャリア懸濁液の調製工程：シードマイクロキャリアの細胞密度が１０，０００～１，０００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリアを細胞培養培地で０．１～５０ｍｇ／ｍＬに再懸濁してシードマイクロキャリア懸濁液を得る；（Ｈ２）接種工程：（Ｈ１）で調製されたシードマイクロキャリア懸濁液を新しいマイクロキャリアに滴下する、シードマイクロキャリアと新しいマイクロキャリアとの比は０．０００２～２００ｍｇシードマイクロキャリア／ｍｇ新しいマイクロキャリアであり、十分に混合し、インキュベーションするためにインキュベーター中に０．５～２４時間置く；（Ｈ３）培養工程：細胞培養培地を添加し、培養を継続する、すなわち静的なｉｎｓｉｔｕ継代を完了する、を含む。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
工程（Ｇ１）において、インペラ内蔵細胞培養フラスコに入れた新しいマイクロキャリアと細胞培養培地の割合がマイクロキャリア１００ｍｇ／細胞培養培地１０ｍＬであり、インペラ内蔵細胞培養フラスコに入れた後、０．１～２４時間放置し方法；
工程（Ｇ２）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度は、１５０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり；および／またはシードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量が１～１０ｍｇ／ｍＬである；
工程（Ｇ３）、シードマイクロキャリアの新しいマイクロキャリアに対する比率は１～１０ｍｇのシードマイクロキャリア／１００ｍｇの新しいマイクロキャリアであり；および／またはマイクロキャリアの培地に対する比率が細胞培養培地を添加することによって１～１０ｍｇ：１ｍＬに調節され；および／または撹拌速度が１ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、撹拌は定速撹拌または可変速交互撹拌または可変速周期撹拌によるものであり、撹拌方向は、時計方向撹拌、反時計方向撹拌または交互方向撹拌である方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の方法であって、
工程（Ｈ１）において、シードマイクロキャリア中の細胞密度が１２０，０００～５００，０００細胞／ｍｇマイクロキャリアであり、シードマイクロキャリア懸濁液中のシードマイクロキャリアの含有量が５～１５ｍｇ／ｍＬであり方法；
工程（Ｈ２）において、シードマイクロキャリア対新しいマイクロキャリアの比は、１～３ｍｇシードマイクロキャリア／２０ｍｇ新しいマイクロキャリアであり；および／またはインキュベーション時間が０～２４時間である方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養の分野に関し、特に幹細胞の大規模調製のための三次元（３Ｄ）培養方法に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
幹細胞は自己複製能を有する多能性細胞の一種であり、適切な条件下で誘導した後、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、腎細胞、肝細胞など様々な機能細胞に分化することができる。幹細胞研究の発展に伴い、幹細胞の医学的価値は計り知れないものであり、臨床応用の可能性は医療の発展に大きな影響を与えている。幹細胞、ならびにその分泌物は、腫瘍、脊髄損傷、多発性硬化症、卒中、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、変形性関節症、大腿骨頭壊死、椎間板変性、心筋梗塞、肝硬変、クローン病、間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス、勃起不全、および早発性卵巣不全などの様々な疾患の治療において役割を果たすことがいくつかの研究で証明されている。再生医療に用いることができる幹細胞には間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、脂肪細胞幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などが含まれるが、これらに限定されず、これらの中でＭＳＣが最も臨床的に使用されている。
【０００３】
幹細胞は、世界中の多くの国において、管理および承認のための「薬剤」と考えられている。現在、国際的に利用可能な幹細胞治療製品は１４種類あるが、中国では未だに承認された製品はない。しかし、２０１８年以降、中国の幹細胞薬剤が医薬品の監督・管理により規制されるようになり、中華人民共和国国家医療製品管理局（ＮＭＰＡ）が幹細胞薬剤の一部を承認し、そのうち３つがＩＮＤ（臨床試験申請）により臨床試験に参加することが承認されている。同時に、５１件の幹細胞臨床研究が中華人民共和国国家衛生健康委員会に提出され、臨床研究の実施が許可されている。これらの数字は、中国が幹細胞薬剤の開発および変革の急速な発展段階に入ることを意味する。
【０００４】
幹細胞とそれに由来する細胞産物は、不均一性や活性の変化などの特殊な性質から、長い間薬剤になりにくいと考えられてきた。伝統的な「化学薬剤」および「タンパク質、核酸」および他の生物学的薬剤と比較して、新たな細胞薬剤の製造および調製は、より複雑かつ困難である。しかしながら、現在、外国で市販されている幹細胞製品および国内臨床試験または研究用幹細胞製品の両方の製造プロセスは、依然として、人工培養の伝統的な二次元調製プロセスに依拠している。この調製方法は多数の手動操作、煩わしい工程、および過度に労働集約的なオープンエンドプロセスに依存し、これは、操作を標準化すること、および種々の細胞治療の必要性を満たすために必要とされる大量の細胞を産生することを困難にする。必要とされる高コストおよび大面積の生産スペースに加えて、生産される細胞産物のバッチの数が限られていること、および各プロセスにおける不確実性および制御不能な要因のためにバッチ毎の幹細胞の不安定な品質によって引き起こされる安全性の問題は、すべて、幹細胞が大規模適用のための薬剤になる可能性を疑問視している。したがって、今後、細胞を市場性のある市販製品に製剤化する場合、その規模は同じ製造バッチで１０
１１
以上の細胞数を必要とすることがある。とりわけ、細胞製品が治療作用を達成するために多数回の高用量を必要とする場合、そのような量は、現存する製造プロセスによって一貫してかつ適時に提供することができない。したがって、幹細胞治療産業を推進し、臨床グレードの幹細胞調製を可能にするための重要な因子として、操作を単純化し、手動操作を低減し、幹細胞の閉鎖的または半閉鎖的な大規模培養を可能にすることができる方法を確立することが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、幹細胞の大規模調製のための三次元培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法、三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎｓｉｔｕ継代方法、および三次元マイクロキャリアに基づくｉｎｓｉｔｕ細胞凍結保存方法を含む、三次元マイクロキャリアに基づく細胞培養方法のセットを提供する。
三次元マイクロキャリアに基づく細胞蘇生方法は以下の工程：細胞蘇生および培養のために、三次元マイクロキャリア上に解凍後に、凍結保存細胞または凍結保存細胞微小組織の細胞懸濁液を接種する工程を含み；
三次元マイクロキャリア細胞培養に基づくｉｎｓｉｔｕ継代方法は、以下の工程：シードマイクロキャリアを新しいマイクロキャリアに挿入する工程を含み；該シードマイクロキャリアが継代される細胞と共に培養されるマイクロキャリアであり；
三次元マイクロキャリアに基づくｉｎｓｉｔｕ細胞凍結保存方法は、以下の工程
（Ａ１）細胞の三次元マイクロキャリア懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、細胞含有キャリアを得る工程と；（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた細胞含有キャリアを凍結保存溶液と混合し、極低温貯蔵管に加える工程と；
（Ａ３）工程（Ａ２）で細胞含有キャリアを加えた極低温貯蔵管を冷却し、次いでそれを液体窒素に移し、三次元マイクロキャリア上の細胞のｉｎｓｉｔｕ凍結保存を可能にする工程と、を含む。
【０００７】
本方法はさらに、三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法、およびマイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法を含む。三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は、三次元マイクロキャリア上で細胞を接種するために使用され、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、三次元マイクロキャリアから細胞を分離するために使用され、マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は、マイクロキャリア上で培養された細胞の総数および／または細胞密度の計算を実行するために使用される。
【０００８】
三次元マイクロキャリア上での細胞付着培養の方法は、以下の工程：（Ｂ１）細胞接種：細胞懸濁液と乾燥三次元マイクロキャリアとを混合して、細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアを得る工程と；（Ｂ２）細胞付着：細胞が三次元マイクロキャリアに付着するように、工程（Ｂ１）で得られた細胞懸濁液と混合されたマイクロキャリアをインキュベートする工程と；（Ｂ３）細胞培養：工程（Ｂ２）での細胞付着後、完全培養培地を添加し、培養を実施する工程と、を含む。
【０００９】
三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する方法は、以下の工程：（Ｃ１）培養細胞が付着した三次元マイクロキャリアを自然沈殿または遠心分離し、上清を除去して細胞を含む三次元マイクロキャリアを得る工程と；（Ｃ２）細胞を含む三次元マイクロキャリアに溶解液を添加し、その中の三次元マイクロキャリアをインキュベートおよび溶解する工程と；（Ｃ３）工程（Ｃ２）において三次元マイクロキャリアを完全に溶解した後、溶解を終了させるために停止液を添加する工程、または直接工程（Ｃ４）に進んで溶解を終了させる工程と；（Ｃ４）工程（Ｃ３）において得られた系を遠心分離し、上清を廃棄し、三次元マイクロキャリア上の細胞を採取する工程と、を含む。
【００１０】
マイクロキャリア上で培養された細胞をサンプリングする方法は、以下の工程：（Ｄ１）細胞培養のための所定重量のマイクロキャリアを秤量し、それらをサンプリングチューブに入れ、細胞培養プロセスをシミュレートするために液体を添加し、それらを４～６０℃で０～２４時間浸漬し、次いで、サンプリングチューブ上のマイクロキャリアによって占有される体積に対応するスケールを標準スケールとしてマーキングする工程と；（Ｄ２）マイクロキャリア上で培養された細胞を、次のように、マイクロキャリアの体積を標準スケールにするために、サンプリングチューブを用いて細胞培養系からマイクロキャリアをサンプリングする工程と、を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許