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公開番号2025023919
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-19
出願番号2024179648,2023002879
出願日2024-10-15,2018-03-13
発明の名称酸性pHでVISTAに結合する抗体
出願人ファイヴプライムセラピューティクスインク,ブリストル-マイヤーズスクイブカンパニー
代理人園田・小林弁理士法人
主分類C07K 16/28 20060101AFI20250212BHJP(有機化学)
要約【課題】VISTAに特異的に結合する抗体、およびがん治療におけるそれらの使用を提供する。
【解決手段】T細胞活性化のVドメイン免疫グロブリン含有サプレッサー(VISTA)に酸性pHで特異的に結合する抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体は、酸性pHではヒトVISTAに特異的に結合するが、中性または生理的pHではヒトVISTAに有意には結合しない。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
酸性条件でｈＶＩＳＴＡに特異的に結合する単離された抗体。
続きを表示（約 930 文字）【請求項２】
酸性条件でｈＶＩＳＴＡに特異的に結合するが、中性または生理的条件では有意には結合しない、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
酸性条件では、中性または生理的条件でのそのＫ
Ｄ
の１０分の１以下のＫ
Ｄ
で、ｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
酸性条件では、中性または生理的条件でのそのＫ
Ｄ
の１００分の１以下のＫ
Ｄ
で、ｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
酸性条件では、中性または生理的条件でのそのＫ
Ｄ
の１０００分の１以下のＫ
Ｄ
で、ｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
中性または生理的条件では、１０
－５
Ｍまたはそれよりも大きなＫ
Ｄ
でｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
中性または生理的条件では、１０
－４
Ｍまたはそれよりも大きなＫ
Ｄ
でｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
中性または生理的条件では、１０
－３
Ｍまたはそれよりも大きなＫ
Ｄ
でｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項９】
酸性条件では、１０
－７
Ｍまたはそれよりも小さなＫ
Ｄ
でｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
酸性条件では、１０
－８
Ｍまたはそれよりも小さなＫ
Ｄ
でｈＶＩＳＴＡに結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された抗体。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本出願は、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に酸性ｐＨで特異的に結合する抗体、およびがん治療におけるそれらの使用に関する。
続きを表示（約 12,000 文字）【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ含有サプレッサー、すなわちＶＩＳＴＡは、骨髄単球性細胞および他の白血球により発現されるＢ７ファミリーの免疫受容体の共阻害性メンバーである。しかしながら、ＶＩＳＴＡが免疫応答を抑制する機序はよく理解されていない。
【０００３】
本発明者らは、ＶＩＳＴＡが、他の既知免疫受容体とは異なり、酸性ｐＨにてその対抗受容体に選択的にエンゲージし機能するが、生理的ｐＨ（例えば、７．３～７．４）では活性が非常に低いことを見出した。したがって、ＶＩＳＴＡは、血中を循環する細胞を妨害せずに、または非炎症性非酸性組織に滞留せずに、腫瘍床または炎症部位などの酸性微小環境において免疫応答を抑制する可能性がある。加えて、本発明者らは、抗ＶＩＳＴＡ抗体を、ＶＩＳＴＡ自体の酸性ｐＨ選択性と同様に、酸性ｐＨではＶＩＳＴＡに選択的に結合するが、生理的ｐＨではほとんどまたはまったく結合しないように操作することができることを見出した。こうした酸性ｐＨ選択的抗体は、生理的ｐＨでＶＩＳＴＡに結合する抗体に比べて、がんなどの疾患を治療するための望ましい特質を提供することができる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、酸性ｐＨで（例えば、酸性条件で）、ヒトＶＩＳＴＡ（「ｈＶＩＳＴＡ」または「ｈｕＶＩＳＴＡ」）などのＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗体に関する。また、本開示は、酸性ｐＨではｈＶＩＳＴＡなどのＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合するが、中性または生理的ｐＨではほとんどまたはまったく結合しない抗体に関する。本発明者らは、本明細書において、ｈＶＩＳＴＡ－ＥＣＤアミノ酸配列は、多くの保存ならびに非保存ヒスチジン残基を含み、ＶＩＳＴＡのＥＣＤにおけるヒスチジン残基の頻度は、他のＢ７ファミリーメンバーおよび他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーと比べて非常に高いことを認識した。（図１Ａおよび１Ｂを参照。）アミノ酸ヒスチジンは、溶液中で約６．５のｐＫａを有する。これは、ｐＨ６．５またはそれよりも低いｐＨでは、タンパク質内のヒスチジン残基が、多くの場合でプロトン化されており、したがって正に荷電されているが、ｐＨ６．５よりも高いｐＨでは、次第に非プロトン化され、電荷が中性になることを意味する。腫瘍微小環境および炎症組織は酸性であることが多いため、こうした微小環境に見出されるＶＩＳＴＡタンパク質は、ヒスチジン残基が少なくとも部分的にプロトン化されている可能性がある。本明細書で考察されているように、本発明者らは、ヒスチジンプロトン化が、ＶＩＳＴＡの立体構造、表層構造、および／または電荷密度に影響を及ぼす可能性があり、ひいては、それにより受容体－リガンド相互作用および抗体結合の両方のｐＨ特異的またはｐＨ選択的エピトープが生成される可能性があるという仮説を立てた。酸性ｐＨで結合するが、中性または生理的ｐＨでは結合しない抗体でＶＩＳＴＡを標的とすることにより、循環中のおよびリンパ系器官滞留性の骨髄単球性細胞による標的媒介性薬物動態を防止し、腫瘍微小環境における抗体ＰＫ、受容体占有、および活性を向上させることができる。また、酸性ｐＨ選択的抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、およびペイロード（抗体－薬物コンジュゲート）の送達などの、治療モダリティの場合、循環中ではなく腫瘍内にて、標的細胞に対するＶＩＳＴＡ抗体の特異性を向上させることができる。
【０００５】
２０１８年２月２８に出願された、優先権主張米国特許仮出願第６２／６３６，７４６号には、幾つか図面のカラー版が提供されている。その優先権出願ファイルは、本出願の公開により入手可能になっており、カラー図面のコピーは、必要な料金を支払えば請求により、米国特許商標局から提供されることになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインが、非常に高頻度のヒスチジン残基を含み、そうしたヒスチジン残基の多くは保存されており、そうしたヒスチジン残基の少なくとも一部は、受容体－リガンド結合に関与することができることを示す図である。また、免疫グロブリンドメイン含有タンパク質のグラフであり、各タンパク質の細胞外ドメインアミノ酸残基の数がＸ軸にプロットされており、各タンパク質の細胞外ドメイン内のヒスチジン残基の頻度がＹ軸にプロットされている。各データポイントのサイズは、各タンパク質の細胞外ドメインのヒスチジン残基の総数に対応する。
ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインが、非常に高頻度のヒスチジン残基を含み、そうしたヒスチジン残基の多くは保存されており、そうしたヒスチジン残基の少なくとも一部は、受容体－リガンド結合に関与することができることを示す図である。また、ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍａｃａｑｕｅ）、およびマウスＶＩＳＴＡの細胞外ドメインのアラインされたアミノ酸配列を示す。シグナルペプチド（Ｓｉｇ）および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）配列位置には印が付けされている。３つの種すべてにわたって保存されているヒスチジン残基は、太字および下線で示されており、ヒトおよびシノルモグス・マカク（cynolmogus macaque）にわたって保存されているヒスチジン残基は、太字のみで示されている。
ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインが、非常に高頻度のヒスチジン残基を含み、そうしたヒスチジン残基の多くは保存されており、そうしたヒスチジン残基の少なくとも一部は、受容体－リガンド結合に関与することができることを示す図である。また、ヒトＶＩＳＴＡ免疫グロブリンドメインの三次元構造のモデルを示す。ヒスチジン残基は、球棒型トレースとして示されている。
ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインのヒスチジン残基が、生理的ｐＨではなく酸性ｐＨにて対抗受容体選択性を付与するモデルを示す図である。また、ヒスチジン残基のピロールアンモニウム基（ＮＨ）のプロトン化の欠如と存在とが平衡状態にあることを示す。溶液中でのヒスチジンのｐＫａは、６．５である。これは、ヒスチジン残基が、ｐＨ６．５およびそれよりも低いｐＨでは、より高いｐＨよりもプロトン化されている可能性がより高く、したがって正に荷電されている可能性がより高いことを示す。
ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインのヒスチジン残基が、生理的ｐＨではなく酸性ｐＨにて対抗受容体選択性を付与するモデルを示す図である。また、ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨで、Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ－１）または他の対抗受容体およびリガンド（「ＶＩＳＴＡ－Ｒ」）に選択的にエンゲージするモデルを示す。したがって、生理的ｐＨではなく酸性ｐＨにてＶＩＳＴＡの細胞外ドメインに結合する抗体は、ＶＩＳＴＡ活性の阻害または調節に重要である可能性がある。
腫瘍浸潤性マクロファージ、樹状細胞、好中球、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＢ細胞上のＶＩＳＴＡ表面発現のレベル（抗ＶＩＳＴＡ抗体染色の平均蛍光発光強度（ＭＦＩ））を示す図である。ＶＩＳＴＡは、多数の腫瘍浸潤性白血球、特に骨髄細胞上に発現される。腫瘍微小環境は酸性であることが多く、ＶＩＳＴＡは、対抗受容体およびリガンドとエンゲージすることが可能である。
ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨでは白血球およびＰＳＧＬ－１に選択的に結合するが、中性ｐＨではほとんどまたはまったく結合せず、この結合は、抗ＶＩＳＴＡ抗体によるブロックすることができることを示す図である。図４Ａの左側は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する蛍光コンジュゲート組換えＶＩＳＴＡ多量体の代表的なヒストグラムを示す。塗潰しヒストグラムは、より濃い灰色からより薄い灰色に向かってｐＨ７．０、６．５、６．４、６．３、６．１、および６．０での結合を示す。一部のヒストグラムには、それらの対応するｐＨが表記されている。ｐＨ６．０で結合する非ＶＩＳＴＡコントロール多量体は、塗潰無しヒストグラムとして示される。右側には、２つのドナーに由来する活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するＶＩＳＴＡ（円形）およびコントロール（三角形）多量体の様々なｐＨにおける平均ＭＦＩがグラフ化されている。
ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨでは白血球およびＰＳＧＬ－１に選択的に結合するが、中性ｐＨではほとんどまたはまったく結合せず、この結合は、抗ＶＩＳＴＡ抗体によるブロックすることができることを示す図である。図４Ｂは、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４にて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に結合する組換えＶＩＳＴＡ多量体の代表的なヒストグラムを示す。塗潰しヒストグラムは、より濃い灰色からより薄い灰色に向かって、ｐＨ６．０での、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、およびＣＤ１４＋単球に対する結合を示す。塗潰無しの実線境界線および点線境界線ヒストグラムは、ｐＨ７．４での、それぞれＰＢＭＣリンパ球および単球に対する結合を示す。
ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨでは白血球およびＰＳＧＬ－１に選択的に結合するが、中性ｐＨではほとんどまたはまったく結合せず、この結合は、抗ＶＩＳＴＡ抗体によるブロックすることができることを示す図である。図４Ｃは、抗体（正方形）または非ＶＩＳＴＡ特異的アイソタイプ一致コントロール抗体（円形）をブロックする抗ＶＩＳＴＡの存在下での、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する代表的な組換えＶＩＳＴＡ多量体の結合を示す。抗体濃度は、対数スケールでプロットされている。非線形回帰曲線も示されている。三角形は、組換えＶＩＳＴＡ多量体で染色されなかった活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に由来するバックグランドシグナルを示す。
ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨでは白血球およびＰＳＧＬ－１に選択的に結合するが、中性ｐＨではほとんどまたはまったく結合せず、この結合は、抗ＶＩＳＴＡ抗体によるブロックすることができることを示す図である。また、ヒトＰＳＧＬ－１を発現するようにトランスフェクトされたヘパラン硫酸欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（系統ｐＧＳＤ－６７７、アメリカンタイプカルチャーコレクション）にｐＨ６．０で結合する組換えＶＩＳＴＡ多量体の代表的な二次元フローサイトメトリープロットを示す。多量体結合は、図４Ｃで示されている抗ＶＩＳＴＡブロックキング抗体の存在下および非存在下で実施した。組換えＶＩＳＴＡ多量体で未染色のままだった細胞は、コントロールとして示されている。ＰＳＧＬ－１抗体染色がＹ軸にプロットされており、ＶＩＳＴＡ多量体染色がＸ軸にプロットされている。
ｐＨ６．０およびｐＨ７．４にてマウス脾細胞に結合する組換えマウスＶＩＳＴＡ－Ｆｃ融合タンパク質の代表的なヒストグラムを示す。塗潰しヒストグラムは、より濃い灰色からより薄い灰色に向かって、ｐＨ６．０での、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞に対する結合を示す。塗潰無しのヒストグラムは、ｐＨ７．４での全脾細胞に対する結合を示す。
ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨにてＴ細胞抑制および細胞間接着を優先的に媒介し、両効果が、抗ＶＩＳＴＡブロッキング抗体により逆行させることができることを示す図である。Ａは、ｐＨ６．０および７．０における、ｈＶＩＳＴＡまたはベクターコントロールを発現する２９３Ｔ細胞（ｙ軸にプロットされている）と、ｘ軸の細胞表面ヘパラン硫酸を内因的に発現するＣＨＯ細胞との間の代表的な細胞間コンジュゲート形成を示す。Ｂは、抗ＶＩＳＴＡブロックキング抗体、抗ＶＩＳＴＡ非ブロックキング抗体、またはアイソタイプ一致非ＶＩＳＴＡ特異的コントロール抗体の存在下でｐＨ６．０にて形成された同じ細胞間の細胞コンジュゲートの頻度を示すグラフである。
ＶＩＳＴＡが、酸性ｐＨにてＴ細胞抑制および細胞間接着を優先的に媒介し、両効果が、抗ＶＩＳＴＡブロッキング抗体により逆行させることができることを示す図である。Ｃは、ｈＶＩＳＴＡおよび抗ヒトＴ細胞受容体アゴニスト抗体ＯＫＴ３の単鎖可変断片を発現する２９３Ｔ細胞（「人工抗原提示細胞」）と共に種々のｐＨで共培養した後で、ＮＦｋＢルシフェラーゼレポーターを発現するジャーカット（ヒトＴ細胞株）細胞により生成されたルシフェラーゼ活性の代表的なプロットを示す。抗ＶＩＳＴＡブロックキング抗体（正方形）またはアイソタイプ一致非ＶＩＳＴＡ特異的コントロール抗体（円形）を、共培養細胞に添加した。Ｄには、図５Ａの中で示されているデータが、コントロールと比べた、抗ＶＩＳＴＡ抗体処置によるルシフェラーゼシグナルの倍数増としてプロットされている（「効果サイズ」）。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ａは、ヒトＶＩＳＴＡを発現する２９３Ｔ細胞内での、ＶＩＳＴＡ、Ｒａｂ５（初期エンドソームマーカー）、Ｒａｂ７（後期エンドソームマーカー）、およびＲａｂ１１（再循環エンドソームマーカー）の共局在化を示す。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ｂは、ヒト単球内でのＶＩＳＴＡおよびＲａｂ１１の共局在化を示す。細胞内ＶＩＳＴＡは、Ｒａｂ１１＋再循環エンドソームと共局在化されている。ＶＩＳＴＡ抗体と同じアイソタイプの非ＶＩＳＴＡ結合コントロール抗体（「ｃＡｂ」）は、単球に対する検出可能な結合を示さない。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ｃは、ｐＨ７．４（黒色）、６．７（より濃い灰色）、および６．（より薄い灰色）における、組換えＶＩＳＴＡに対する３つの抗ＶＩＳＴＡ抗体の結合を示す。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ｄは、カテプシンＢ感受性リンカーおよび細胞傷害ペイロードを有する同じ抗ＶＩＳＴＡ抗体１（逆三角形）、２（円形）、および３（正方形）、または非ＶＩＳＴＡ特異的コントロール抗体（三角形）による死滅に対する、ＶＩＳＴＡ発現急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株の感受性を示す。細胞生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＬＵ）がＹ軸にプロットされており、抗体濃度がＸ軸にプロットされている。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ｅには、抗ＶＩＳＴＡ抗体３のｈＶＩＳＴＡ結合が、酸性ｐＨで結合不良を示さない操作された変異体（「ＶＩＳＴＡｍＡｂ３ｃ」）のｈＶＩＳＴＡ結合に対して比較されている。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ｆは、抗ＶＩＳＴＡ抗体３（正方形）および３ｃ（菱形）の力価を比較した抗体薬物－コンジュゲートアッセイを示す。
ＶＩＳＴＡを、細胞内エンドソーム、特にＲａｂ１１＋再循環エンドソームに見出すことができ、ＶＩＳＴＡは、エンドソーム輸送により細胞表面へとおよび細胞表面から再循環することができることを示す図である。図６Ｇは、エンドソーム輸送のスキームを示し、ＶＩＳＴＡは、初期エンドソームおよび再循環エンドソームにより、細胞表面へとおよび細胞表面から再循環する。
抗ＶＩＳＴＡ抗体変異体ライブラリーをどのように設計したか、および酸性ｐＨ選択的抗体を得るためにどのようにスクリーニングしたかを示す図である。図７Ａは、スクリーニング用’０２９ライブラリーを生成するために、抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体クローンＰ１－０６１０２９（’０２９と省略される）のＶＨＣＤＲ３になされたアミノ酸置換を示す。ＶＩＳＴＡのヒスチジンリッチ領域に対する酸性ｐＨでの結合を潜在的に向上させるために、ライブラリーでは、負荷電アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸ならびにｐＨ応答性ヒスチジンの置換を可能にした。Ｘ＝Ｈ、Ｄ、またはＥ。角括弧付き配列は、不安定性の導入を回避するために合成から除去した。１～２つの突然変異を有するＰ１－０６１０２９ＨＣＤＲ３の合計６４７個のユニーク配列を合成した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体変異体ライブラリーをどのように設計したか、および酸性ｐＨ選択的抗体を得るためにどのようにスクリーニングしたかを示す図である。図７Ｂは、’０２９ライブラリーを反復スクリーニングし、酸性ｐＨ選択的抗体変異体を選択する手順を示す。Ｒは、選択ラウンドを示す。
抗ＶＩＳＴＡ抗体変異体ライブラリーをどのように設計したか、および酸性ｐＨ選択的抗体を得るためにどのようにスクリーニングしたかを示す図である。図７Ｃは、９ラウンドの選択後の変異体プールを示す、代表的な二次元フローサイトメトリープロットデータを示す。ＶＩＳＴＡ結合がＹ軸にプロットされており、変異体抗体発現がＸ軸にプロットされている。種々の抗体濃度およびｐＨでの結合データが示されている。
抗ＶＩＳＴＡ抗体変異体ライブラリーをどのように設計したか、および酸性ｐＨ選択的抗体を得るためにどのようにスクリーニングしたかを示す図である。図７Ｄは、ｐＨ６．０および７．４における、ヒトＶＩＳＴＡに対するＰ１－０６１０２９およびその子孫クローンの結合のダイアグラムを示す。
抗ＶＩＳＴＡ抗体変異体ライブラリーをどのように設計したか、および酸性ｐＨ選択的抗体を得るためにどのようにスクリーニングしたかを示す図である。図７Ｅは、ｐＨ６．０における、ヒトＶＩＳＴＡに対するＰ１－０６１０２９およびその子孫クローンの解離速度のダイアグラムを示す。
抗ＶＩＳＴＡ抗体変異体ライブラリーをどのように設計したか、および酸性ｐＨ選択的抗体を得るためにどのようにスクリーニングしたかを示す図である。図７Ｆは、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４における、ヒトＶＩＳＴＡに対する抗体Ｐ１－０６８７６１、Ｐ１－０６８７６７、およびＰ１－０６１０２９のＳＰＲ結合データを示す。
ＶＩＳＴＡ抗体Ｐ１－０６８７６１およびＰ１－０６８７６７のｐＨ選択的細胞結合、ブロックキング、およびエフェクター活性を示す図である。ＡおよびＢは、ヒトＶＩＳＴＡを異所的に発現するラージ細胞に対する、酸性ｐＨ選択的抗体Ｐ１－０６８７６１（図８Ａ）およびＰ１－０６８７６７（図８Ｂ）結合の平均蛍光発光強度を示す。細胞を、およそｐＨ６．０（円形；図８Ａで最も上方にある曲線）、６．１（正方形；３番目に上方にある曲線）、６．２（三角形；２番目に上方にある曲線）、６．４（逆三角形；ｐＨ６．１曲線に近い４番目に上方にある曲線）、６．６（菱形；下から４番目の曲線）、７．０（円形；下から３番目の曲線）、７．２（正方形；下から２番目の曲線）、および８．１（塗潰無しの三角形；図８Ａで最も下方の曲線）にて染色した。結合は、蛍光コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出した。
ＶＩＳＴＡ抗体Ｐ１－０６８７６１およびＰ１－０６８７６７のｐＨ選択的細胞結合、ブロックキング、およびエフェクター活性を示す図である。図８Ｃは、ヒトＶＩＳＴＡを異所的に発現するラージ細胞に対する、３１２５ｎｇ／ｍＬのＰ１－０６８７６７（円形）およびアイソタイプ一致非特異的コントロール抗体（三角形）の種々のｐＨにおける結合を示す。「ｐＨ
５０
」、つまりＰ１－０６８７６７結合の５０％が失われるｐＨは、およそ６．６である。
ＶＩＳＴＡ抗体Ｐ１－０６８７６１およびＰ１－０６８７６７のｐＨ選択的細胞結合、ブロックキング、およびエフェクター活性を示す図である。図８Ｄは、ヒト単球に対する、アイソタイプ一致非特異的コントロール抗体（塗潰しおよび塗潰無し円形は、それぞれｐＨ７．０および６．０）、抗ＶＩＳＴＡｍＡｂ２（「コントロール」、図６Ｃを参照、塗潰しおよび塗潰無し正方形は、それぞれｐＨ７．０および６．０）、Ｐ１－０６８７６１（塗潰しおよび塗潰無し三角形は、それぞれｐＨ７．０および６．０）、およびＰ１－０６８７６７（塗潰しおよび塗潰無し逆三角形は、それぞれｐＨ７．０および６．０）結合の平均蛍光発光強度（ＭＦＩ）を示す。結合は、蛍光コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出した。
ＶＩＳＴＡ抗体Ｐ１－０６８７６１およびＰ１－０６８７６７のｐＨ選択的細胞結合、ブロックキング、およびエフェクター活性を示す図である。図８Ｅは、ｐＨ６．０では、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する組換えＶＩＳＴＡ多量体結合が、Ｐ１－０６１０２９（正方形）、Ｐ１－０６８７６１（三角形）、およびＰ１－０６８７６７（逆三角形）により同等にブロックされたが、非ＶＩＳＴＡ特異的コントロール抗体（円形）は、ＶＩＳＴＡ結合をブロックしなかったことを示す。
ＶＩＳＴＡ抗体Ｐ１－０６８７６１およびＰ１－０６８７６７のｐＨ選択的細胞結合、ブロックキング、およびエフェクター活性を示す図である。図８Ｆは、生理的ｐＨでは、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の媒介における、Ｐ１－０６８７６１（三角形）およびＰ１－０６８７６７（逆三角形）の力価が低減されたことを示す。Ｐ１－０６１０２９（正方形）、非ＶＩＳＴＡ特異的ポジティブコントロール抗体（円形）、および非ＶＩＳＴＡ特異的陰性コントロール抗体（菱形）も示されている。全標的細胞のパーセンテージとしての標的細胞のＮＫ細胞特異的溶解がＹ軸にプロットされており、抗体濃度がＸ軸にプロットされている。非線形回帰曲線も示されている。
カニクイザルにおける、酸性ｐＨ選択的抗ＶＩＳＴＡ抗体の薬物動態（ＰＫ）が増強されたことを示す図である。この図は、ＶＩＳＴＡ抗体２（「コントロール」、円形、図６Ｃを参照）、ＶＩＳＴＡ抗体３（「酸性ｐＨ感受性」、正方形、図６Ｃを参照）、またはＰ１－０６８７６７（三角形）で処置したカニクイザルの経時的な血清抗体濃度を示す。
酸性ｐＨ選択的抗ＶＩＳＴＡ抗体’７６１および’７６７における突然変異が結合に及ぼす影響を示す図である。図１０Ａは、ｐＨ７．４、ｐＨ６．７、およびｐＨ６．０におけるＰ１－０６８７６１復帰突然変異体の動力学的結合データ、およびＰ１－０６８７６１に対する復帰突然変異の位置を示す。
酸性ｐＨ選択的抗ＶＩＳＴＡ抗体’７６１および’７６７における突然変異が結合に及ぼす影響を示す図である。図１０Ｂは、ｐＨ７．４、ｐＨ６．７、およびｐＨ６．０におけるＰ１－０６８７６１復帰突然変異体の動力学的結合データ、およびＰ１－０６８７６７に対する復帰突然変異の位置を示す。
種々の抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープビニング（epitope binning）およびマッピングを示す図である。図１１Ａは、Ｐ１－０６１０２９およびＶＩＳＴＡ抗体コントロールと比較した、Ｐ１－０６８７６１およびＰ１－０６８７６７のＶＩＳＴＡエピトープ競合を示す。
種々の抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープビニング（epitope binning）およびマッピングを示す図である。ＢおよびＣは、非ブロックキングｈＶＩＳＴＡ抗体（ｍＡｂ１；図１１Ｃ）と比較した、表１４に列挙されているブロックキングｈＶＩＳＴＡ抗体（図１１Ｂ）の全エピトープ残基の図示を示す。アミノ酸残基６６（Ｈ）および１６２（Ａ）は、分子の向きを表すために示されている。ヒスチジン残基は灰色であり、エピトープ残基は黒色である。
以下の画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）データを示す図である：図１２Ａ：Ｐ１－０６１０２９、図１２Ｂ：Ｐ１－０６８７６１、および図１２Ｃ：Ｐ１－０６８７６７。主要な種（主ｐＩ）ならびにｐＩマーカーの等電点が示されている。
’０２９および’０１５子孫クローンの可変領域のアラインメントを示す図である。図１３Ａは、’０２９およびその子孫クローンの可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図１３Ａの続きである。
’０２９および’０１５子孫クローンの可変領域のアラインメントを示す図である。図１３Ｂは、’０１５およびその子孫クローンの可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
本出願では、「または」の使用は、別様の記載がない限り、「および／または」を意味する。多項従属クレームの状況では、「または」の使用は、１つよりも多くの先行独立クレームまたは択一形式の従属クレームのみを参照する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、本明細書では同義的に使用することができる。本発明によると、「単離された」分子は、その自然環境から取り出された分子である。そのため、用語「単離された」は、分子が精製された範囲を必ずしも反映しない。
【０００８】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小長には限定されない。「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドを含んでいてもよい。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然アミノ酸残基を含んでいてもよく、これらに限定されないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、および多量体が挙げられる。全長タンパク質およびそれらの断片は両方とも、本定義により包含される。また、こうした用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、およびリン酸化などを含む。さらに、本発明の目的では、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に欠失、付加、および置換（一般には性質が保存的）などの修飾を含む、それぞれポリペプチドまたはタンパク質を指す。こうした修飾は、部位特異的突然変異誘発によるものなど、意図的であってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅によるエラーによるものなど、偶発的であってもよい。タンパク質は、２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含んでいてもよい。
【０００９】
「ＶＩＳＴＡ」は、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン含有サプレッサータンパク質の略語であり、Ｂ７ファミリーの免疫チェックポイント制御因子のメンバーである。ＶＩＳＴＡは、ＰＤ－１ホモログ（ＰＤ１Ｈ）、Ｂ７－Ｈ５、Ｃ１０ｏｒｆ５４、分化ＥＳＣ－１（differentiation of ESC-1）（Ｄｉｅｓ－１）、血小板受容体Ｇｉ２４前駆体、およびデスドメイン１α（ＤＤ１α）としても知られている。用語「ｈＶＩＳＴＡ」または「ｈｕＶＩＳＴＡ」は、本明細書では、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質を指す。シグナルペプチドを含むｈＶＩＳＴＡのアミノ酸配列は、配列番号１に提供されており、シグナルペプチドを含まない配列は、配列番号２に提供されている。（下記の配列表を参照されたい。）ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインもしくは「ＥＣＤ」または「ＶＩＳＴＡ－ＥＣＤ」は、細胞外空間に位置するＶＩＳＴＡタンパク質の部分を指し、ｈＶＩＳＴＡの場合、配列番号２のアミノ酸１～１６２を含む。（図１Ｂも参照されたい。）ｈＶＩＳＴＡの「ＩｇＶドメイン」部分は、配列番号２の残基５～１３５を含む。
【００１０】
用語「リーダーペプチド」または「リーダー配列」は、哺乳動物細胞からのポリペプチド分泌を促進する、ポリペプチドのＮ末端基に位置するアミノ酸残基の配列を指す。リーダー配列は、ポリペプチドが哺乳動物細胞から搬出されると切断されて、成熟タンパク質が形成される。リーダー配列は、天然であってもよくまた合成であってもよく、付着されているタンパク質に対して異種性であってもよくまたは同族性であってよい。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許