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公開番号2025017371
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-05
出願番号2024191126,2020065670
出願日2024-10-30,2020-04-01
発明の名称ヒト条件的不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法
出願人学校法人東京薬科大学
代理人弁理士法人フィールズ国際特許事務所
主分類C12N 5/079 20100101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ヒト不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法を提供する。
【解決手段】(i)ヒト条件的不死化ペリサイトを第1の培地に播種して培養するペリサイト培養工程と、(ii)前記培養したヒト条件的不死化ペリサイトを第2の培地において分化させるペリサイト分化工程と、(iii)ヒト条件的不死化アストロサイトを第3の培地に播種して培養するアストロサイト培養工程と、(iv)前記培養したヒト条件的不死化アストロサイトを第4の培地において分化させるアストロサイト分化工程と、(v)ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を第5の培地に播種して、前記播種したヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培養する脳微小血管内皮細胞培養工程とを含む、多細胞血液脳関門モデルの製造方法。
【選択図】図2A
特許請求の範囲【請求項１】
（ｉ）ヒト条件的不死化ペリサイトを第１の培地に播種して培養するペリサイト培養工程と、
（ｉｉ）前記培養したヒト条件的不死化ペリサイトを第２の培地において分化させるペリサイト分化工程と、
（ｉｉｉ）ヒト条件的不死化アストロサイトを第３の培地に播種して培養するアストロサイト培養工程と、
（ｉｖ）前記培養したヒト条件的不死化アストロサイトを第４の培地において分化させるアストロサイト分化工程と、
（ｖ）ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を第５の培地に播種して、前記播種したヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を培養する脳微小血管内皮細胞培養工程と
を含み、
前記ペリサイト培養工程（ｉ）および／または前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）において、ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が形成され、
前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）および／または前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）において、ヒト条件的不死化アストロサイトを含む培養物が形成され、
前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化が、前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養温度とは異なる温度で行われ、
前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が、前記アストロサイト培養工程における培養温度とは異なる温度で行われ、
前記工程（ｉｉ）および前記工程（ｉｖ）の後で、前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）が行われ、
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において、ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が形成され、
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養が、第６の培地中における前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養と共に行われ、
前記ヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物と前記ヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物とが相互作用することが可能なように配置されている、多細胞血液脳関門モデルの製造方法。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）における、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養が、前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化および／または前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とは異なる温度で行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養が３２～３４℃の温度範囲で行われ、前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化が３５～３９℃の温度範囲で行われ、および／または
前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養が３２～３４℃の温度範囲で行われ、前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が３５～３９℃の温度範囲で行われる、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）における、前記播種されたヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞の培養、ならびに、前記ヒト条件的不死化ペリサイトの更なる培養および前記ヒト条件的不死化アストロサイトの更なる培養が、３２～３４℃の温度範囲で行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養および前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養が、それぞれ独立して、播種後１２～７２時間行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化および前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化が、それぞれ独立して、１２～７２時間行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）が、播種後１２～２４０時間行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ペリサイト培養工程（ｉ）における培養と前記アストロサイト培養工程（ｉｉｉ）における培養とが、同時に行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）における分化と前記アストロサイト分化工程（ｉｖ）における分化とが、同時に行われる、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ペリサイト培養工程（ｉ）および／または前記ペリサイト分化工程（ｉｉ）において形成されるヒト条件的不死化ペリサイトを含む培養物が層であり、および／または、
前記脳微小血管内皮細胞培養工程（ｖ）において形成されるヒト条件的不死化脳微小血管内皮細胞を含む培養物が層である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト条件的不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法に関する。
続きを表示（約 5,100 文字）【背景技術】
【０００２】
血液脳関門（ＢｌｏｏｄＢｒａｉｎＢａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）は、脳微小血管内皮細胞（ＢｒａｉｎＭｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ；ＢＭＥＣ）と、その周囲に存在するアストロサイトやペリサイトなどの支持細胞によって形成される（非特許文献１、非特許文献２）。ＢＭＥＣは、ＢＢＢの主要な構成要素であるが、ＢＢＢ特異的な性質を獲得するには、アストロサイトとペリサイトの双方が必要であり、またこれらは共にＢＢＢの制御および維持に重要な役割を果たす（非特許文献３）。
【０００３】
ＢＢＢは、末梢と中枢神経系（ＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍ；ＣＮＳ）との間の重要な境界面を提供し、独立した生理学的恒常性を維持し、かつ、薬剤などの潜在的に有害な化学物質が脳に入るのを防ぐ（非特許文献４、非特許文献５）。ＢＢＢを構成する２つの主な分子実体は、（１）薬剤の脳内への傍細胞流入を厳密に制限する細胞間ジャンクション（タイトジャンクションおよび接着ジャンクション）；および（２）ＢＭＥＣの頂端膜側で種々の薬剤を積極的に運び出す複数の排出トランスポーター（Ｐ糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）および乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）を含む）である（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。
【０００４】
このような特殊な機能のため、優れたＢＢＢ透過性を持つ薬物候補の特定は、ＣＮＳ薬の開発における大きな課題であった。このような状況の下、ｉｎｖｉｔｒｏのＢＢＢモデルは、ＢＢＢ透過性を有するＣＮＳ薬の特定プロセスを促進するための貴重なツールを提供することが期待される。
【０００５】
ＢＭＥＣの単一培養システムはｉｎｖｉｖｏのＢＢＢを正確に模倣しないため、アストロサイトおよび／またはペリサイトとの共培養が、高度かつ特殊な機能を有するＢＢＢモデルの開発に有用な方法であると考えられている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。これを達成するために、さまざまな動物種から得られたＢＢＢ細胞が広く使用されているが、動物とヒトのＢＢＢ機能には、ＢＢＢトランスポーターの発現レベルが異なることによって示されるように、いくつかの相違点があることが明らかになっている（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。したがって、ＣＮＳ薬の開発には、ヒト由来のＢＢＢモデルが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒト条件的不死化細胞を用いた血液脳関門モデルおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
先述のような背景の下、本発明者らは、２つ不死化遺伝子、すなわち、（１）テロメア長を伸長し、成長停止、および細胞分割に伴うテロメア短縮によって生ずるゲノム損傷に対抗するヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子；（２）温度感受性シミアンウイルス４０大腫瘍抗原（ｔｓＳＶ４０Ｔ）遺伝子をヒトの初代ＢＢＢ細胞へと導入することによって、ＢＭＥＣ、アストロサイトおよび脳ペリサイトに由来する、ヒト不死化細胞を樹立した（参考文献２４、参考文献２５、参考文献２６）。
【０００９】
ｔｓＳＶ４０Ｔは、条件付き不死化特性を細胞へ付与する。具体的には、３３℃の培養温度で安定であり、細胞周期を促進するが、３７℃以上の温度において、急速に分解される。それによって、不死化シグナルが消失すると同時に細胞は再分化する（参考文献２４、参考文献２５、参考文献２６、参考文献３０、参考文献３１）。上記２つの遺伝子の機能に基づき、ヒト不死化ＢＢＢ細胞は、継続的な増殖プロファイルを示す重要な細胞特性を保持する。この点は、多様な適用可能性に鑑みて、薬剤開発における、従来の細胞種に対する明らかな利点である。
【００１０】
これらのヒト不死化ＢＢＢ細胞は、薬剤透過性研究におけるヒトＢＢＢモデルの開発に貢献することが期待される。本発明者らは、これまでに本発明者らが樹立したヒト不死化アストロサイト細胞株（ＨＡＳＴＲ／ｃｉ３５）、ヒト不死化脳ペリサイト細胞株（ＨＢＰＣ／ｃｉ３７）およびヒト不死化脳微小血管内皮細胞株（ＨＢＭＥＣ／ｃｉ１８）を用いて、ヒト不死化細胞に基づく多細胞ＢＢＢモデルを開発し、当該ＢＢＢモデルの特性決定を行った。
（【００１１】以降は省略されています）

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