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公開番号2025016776
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024195755,2022152461
出願日2024-11-08,2017-12-29
発明の名称合成ガイド分子、それに関連する組成物および方法
出願人エディタス・メディシン、インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/11 20060101AFI20250128BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ガイド分子の化学合成、およびそれに関連する組成物および方法を提供すること。
【解決手段】本開示は、とりわけ、2つ以上のプレアニールされたガイド断片を架橋することを含む単分子ガイド分子を合成するための方法を提供することによって、最小のn-1種および/またはn+1種、切断種、および他の汚染物質を有する高純度単分子ガイド分子のコスト効率の良い直接的な化学合成の必要性に対処する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、5’末端に改善された配列忠実度を有し、不所望の標的外編集を低減している。また、n-1および/またはn+1汚染を実質的に含まない完全長単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなる組成物も本明細書で提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
本明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４１，０４６号明細書、および２０１７年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４９２，００１号明細書の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの開示は、それらの全体の参照により本明細書に援用される。
続きを表示（約 3,400 文字）【０００２】
本開示は、標的核酸配列を編集するため、または標的核酸配列の発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連方法および構成要素に関する。より詳細には、本開示は、合成ガイド分子、ならびに関連するシステム、方法、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）は、ウィルス攻撃に対して防御するための適応免疫系として細菌および古細菌において進化した。ウィルスにさらされると、ウィルスＤＮＡの短いセグメントが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ＲＮＡは、ウィルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部から転写される。ウィルスゲノムに相補的な配列を含むそのＲＮＡは、ウィルスゲノム中の標的配列へのＣａｓ９またはＣｐｆ１などのＲＮＡガイドヌクレアーゼタンパク質の標的化を媒介する。次に、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ウィルス標的を切断し、それによりウィルス標的をサイレンシングする。
【０００４】
最近、ＣＲＩＳＰＲシステムは真核細胞におけるゲノム編集に適応された。これらのシステムは、一般にタンパク質構成要素（ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）および核酸構成要素（一般に、ガイド分子、ガイドＲＮＡ、または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる）を含む。これらの２つの構成要素は、システムの２つの構成要素によって認識されるかまたはそれに相補的な特定の標的ＤＮＡ配列と相互作用し、任意選択により、例えば部位特異的ＤＮＡ切断によって標的配列を編集または改変する複合体を形成する。標的配列の編集または改変はまた、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などの細胞ＤＮＡ修復機構の動員も含み得る。
【０００５】
遺伝性疾患を処置する手段としてのＣＲＩＳＰＲシステムの価値は広く認識されているが、広い臨床応用を達成するためにこれらのシステムに基づく治療法についてある種の技術的課題に取り組まなければならない。とりわけ、高品質のＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素のコスト効率の良い直接的な商業規模の合成が要望されている。
【０００６】
例えば、ほとんどのガイド分子は現在、２つの方法：インビトロ転写（ＩＶＴ）および化学合成のうちの一方によって合成される。ＩＶＴは、典型的にはＴ７ポリメラーゼなどの細菌ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの転写を含む。現在、米国および海外の規制当局によって要求されている医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従ったガイド分子のＩＶＴ製造は、費用がかかり、規模が限られ得る。さらに、ＩＶＴ合成は、すべてのガイドＲＮＡ配列に適しているとは限らない：Ｔ７ポリメラーゼは、５’グアニンで始まる配列を別の５’塩基で始まる配列よりも効率的に転写する傾向にあり、その構造が特定のガイド分子に存在するポリウラシルトラクトが続くステムループ構造を、転写を終結させるためのシグナルとして認識することができ、切断されたガイド分子の転写が起こる。
一方、化学合成は安価であり、より短いオリゴヌクレオチド（例えば、１００ヌクレオチド長未満）のためのＧＭＰ生産が容易に利用可能である。化学合成法は、例えば、本明細書のすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用されるＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍ．２００１Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ３：Ｕｎｉｔ３．３（Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）による文献を通じて説明されている。これらの方法は、典型的には所望の長さのオリゴヌクレオチド配列に達するまで活性ヌクレオチド単量体を段階的に添加することを含む。最も一般的に使用されている合成法（ホスホラミダイト法など）では、単量体が、オリゴヌクレオチドの５’末端に付加される。これらの単量体は、しばしば（例えばホスホラミダイトで）３’官能化され、例えば、以下の式Ｉ：
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に従った５’保護基（４，４’ジメトキシトリチルなど）を含む。
式Ｉにおいて、ＤＭＴｒは、４，４’－ジメトキシトリチルであり、Ｒは、オリゴヌクレオチド合成条件に適合する基であり、その非限定的な例としては、Ｈ、Ｆ、Ｏ－アルキル、または保護されたヒドロキシル基が挙げられ、Ｂは、任意の適切な核酸塩基である（Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）。５’保護単量体の使用は、添加の各回の後に、５’保護基を除去してヒドロキシル基を残す脱保護ステップを必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
ＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍ．２００１Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ３：Ｕｎｉｔ３．３（Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
いかなる化学を利用しても、５’残基の段階的付加は定量的には起こらない；いくつかのオリゴヌクレオチドは、いくつかの残基の付加に「失敗する」であろう。これにより、所望のオリゴヌクレオチドを含むが、様々な残基を欠くより短いオリゴヌクレオチド（「ｎ－１種」と呼ばれるが、ｎ－２、ｎ－３など、ならびに他の切断種または欠失種を含み得る）で汚染されている合成生成物が得られる。ｎ－１種による汚染を最小限に抑えるために、多くの化学合成スキームは、段階的付加ステップと脱保護ステップとの間に「キャッピング」反応を含む。キャッピング反応において、非反応性部分が、５’保護基によって終端されていないそれらのオリゴヌクレオチドの５’末端に付加される；この非反応性部分は、単量体のオリゴヌクレオチドへのさらなる付加を防止し、約６０または７０塩基長のオリゴヌクレオチドの合成中にｎ－１汚染を許容可能な低レベルに低減するのに有効である。しかしながら、キャッピング反応もまた、定量的ではなく、単分子ガイドＲＮＡなどのより長いオリゴヌクレオチド中のｎ－１汚染を防止するのに効果がない可能性がある。他方、ＤＭＴ保護がカップリング反応中に失われ、より長いオリゴヌクレオチド（「ｎ＋１種」と呼ばれるが、ｎ＋２、ｎ＋３などを含み得る）が得られる場合がある。ｎ－１種および／またはｎ＋１種で汚染された単分子ガイドＲＮＡは、他の手段によって調製された完全長ガイドＲＮＡと同じようには作用しない可能性があり、治療における合成ガイドＲＮＡの使用を複雑にする恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、とりわけ、２つ以上のプレアニールされたガイド断片を架橋することを含む単分子ガイド分子を合成するための方法を提供することによって、最小のｎ－１種および／またはｎ＋１種、切断種、および他の汚染物質を有する高純度単分子ガイド分子のコスト効率の良い直接的な化学合成の必要性に対処する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単分子ガイド分子は、５’末端に改善された配列忠実度を有し、不所望の標的外編集を低減している。また、ｎ－１および／またはｎ＋１汚染を実質的に含まない完全長単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなる組成物も本明細書で提供される。
【００１０】
本開示の特定の態様は、本明細書に記載の尿素に基づく架橋法で使用されるアミン官能化断片などのガイド断片がホモ多官能性（例えば、ホモ二官能性）である場合、ガイド断片のプレアニーリングが特に有用であり得るという認識を包含する。実際、ホモ多官能性ガイド断片をヘテロ二量体にプレアニーリングすることにより、不所望のホモ二量体の形成を低減することができる。したがって、本開示はまた、副生成物（例えば、ホモ二量体）を実質的に含まない完全長の単分子ガイド分子を含むか、または本質的にそれからなる組成物も提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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