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公開番号2025016389
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-31
出願番号2024116299
出願日2024-07-19
発明の名称dxCas9と、CRP誘導体とを含む標的遺伝子発現調節システム及びその製造方法
出願人コリアリサーチインスティチュートオブケミカルテクノロジー,KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250124BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、dxCas9と、CRP誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミドを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、dxCas9と、CRP誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミド、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株、その製造方法、標的遺伝子調節システム、及び標的遺伝子発現調節方法に関し、本発明によるプラスミド、組換え菌株及び発現調節システムは、標的遺伝子の発現を同時・多重調節するシステムを構築することにより、高付加価値物質の生産を向上させることができる。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミド。
続きを表示（約 830 文字）【請求項２】
前記ＣＲＰ誘導体は、ＣＲＰ
ＡＲ１
、ＣＲＰ
ＡＲ３
、ＣＲＰ
ＡＲ２３
又はＣＲＰ
ＡＲ１２３
である、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項３】
前記ＣＲＰ誘導体はＣＲＰ
ＡＲ１２３
である、請求項２に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項４】
前記ＣＲＰ
ＡＲ１２３
は、配列番号５からなる野生型ＣＲＰ
ＷＴ
からＣ末端のＤＮＡ結合モチーフが除去され、ＡＲ１、ＡＲ２及びＡＲ３ドメインを含み、１番目～１８０番目のアミノ酸で構成されるものである、請求項３に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項５】
前記ＣＲＰ
ＡＲ１２３
誘導体は、配列番号６の配列を含む、請求項３に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項６】
前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号１の配列を含む、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項７】
前記発現調節は、標的遺伝子の発現強化又は発現抑制を行うものである、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項８】
前記ｄｘＣａｓ９は、配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカーが結合されたものである、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項９】
前記プラスミドは、標的遺伝子配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
【請求項１０】
前記ガイドＲＮＡは、配列番号２３～２５の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の標的遺伝子発現調節用プラスミド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミド、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株、その製造方法、標的遺伝子調節システム、及び標的遺伝子発現調節方法に関する。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
現在、バイオ産業においては、高付加価値産物を生産するために、産業微生物を代謝工学的に操作し、野生型が生産できない産物を効率的に生産する技術が広く用いられている。それらの技術の核心は、ターゲット物質を効率的かつ経済的に生産することにある。それに用いられる代謝工学的方法としては、プラスミド又はゲノム上に異型遺伝子を挿入する技術や、特定遺伝子の突然変異を起こす技術が挙げられる。特に、近年、ＣＲＩＳＰＲを用いて、標的遺伝子の挿入や突然変異を迅速に行う技術が脚光を浴びている。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ技術は、大腸菌の内在遺伝子又は外部遺伝子を同時、多重に標的とする可能性を有するので、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節システムの開発は、大腸菌による高付加価値物質の生産を向上させることのできる合成生物学ツールとしての潜在力が大きい。しかし、現在まで、真核生物においてＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節ツールが開発された事例はあるが、大腸菌において遺伝子発現活性／抑制を同時に行う調節システムについては相対的に報告が少ない現状である。
【０００４】
こうした背景の下、本発明者らは、大腸菌において同時に多重遺伝子を標的とし、転写活性／抑制の機能を備えた新たなＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子発現調節システムを開発し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
Cheng dong et al., 2018, Nature Communications, 9:2489
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用プラスミドを提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、前記プラスミドで形質転換された組換え菌株を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、ｄｘＣａｓ９と、ＣＲＰ誘導体とを含む標的遺伝子発現調節用システムを提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、ｉ）ｄｘＣａｓ９タンパク質とＣＲＰタンパク質を結合したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムを作製するステップと、ｉｉ）前述したように作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムに蛍光レポータープラスミドをクローニングするステップと、ｉｉｉ）前記ｉｉ）ステップで作製したｄｘＣａｓ９－ＣＲＰシステムにガイドＲＮＡをさらにクローニングするステップと、ｉｖ）前記ｄｘＣａｓ９－ＣＲＰ－ｇＲＮＡを菌株に形質転換するステップとを含む、標的遺伝子発現を調節する組換え菌株の製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、ｄｘＣａｓ９にＣＲＰ誘導体を適用するステップを含むことを特徴とする標的遺伝子発現調節方法を提供することを目的とする。
（【００１１】以降は省略されています）

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