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公開番号2025013804
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-28
出願番号2024173003,2021529789
出願日2024-10-02,2019-11-26
発明の名称クローン選択を容易にするためのシステム及び方法
出願人アムジエン・インコーポレーテツド
代理人弁理士法人川口國際特許事務所
主分類C12Q 1/04 20060101AFI20250121BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】クローン選択に使用される従来の目視検査技術を改善するためのシステム及び方法を提供する。
【解決手段】方法は、第1の画像、及びその後の第2の画像を含む、ウェルの時系列画像を生成することを含む。また、第1の画像を分析することによって、第1の画像に示される1つ以上の候補オブジェクトを検出することと、候補オブジェクトのそれぞれに対して、畳み込みニューラルネットワークを使用してオブジェクトの画像を分析することによって、オブジェクトが単一の細胞であるかどうかを判定することと、を含む。第2の画像を分析することによって、第2の画像に示される細胞群体を検出することと、少なくとも各候補オブジェクトが単一の細胞であると判定されたかどうかに基づいて、群体が1つの細胞のみから形成されたかどうかを判定することと、を更に含む。群体が1つの細胞のみから形成されたかどうかを示す出力データを生成すること、を更に含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
クローン選択を容易にするための方法であって、
第１の画像化ユニットによって、培地を含むウェルの複数の時系列画像を生成することであって、前記複数の時系列画像が、第１の時間に生成された第１の時系列画像、及び前記第１の時間よりも後の第２の時間に生成された第２の時系列画像を含む、ことと、
１つ以上のプロセッサが前記第１の時系列画像を分析することによって、前記第１の時系列画像に示される１つ以上の候補オブジェクトを検出することと、
前記１つ以上の候補オブジェクトのそれぞれに対して、前記１つ以上のプロセッサが畳み込みニューラルネットワークを使用して前記候補オブジェクトの画像を分析することによって、前記候補オブジェクトが単一の細胞であるかどうかを判定することと、
前記１つ以上のプロセッサが前記第２の時系列画像を分析することによって、前記第２の時系列画像に示される細胞群体を検出することと、
前記１つ以上のプロセッサによって、前記１つ以上の候補オブジェクトのそれぞれが単一の細胞であると判定されたかどうかに少なくとも部分的に基づいて、前記細胞群体が１つの細胞のみから形成されたかどうかを判定することと、
前記１つ以上のプロセッサによって、前記細胞群体が１つの細胞のみから形成されたかどうかを示す出力データを生成することと、
を含む、方法。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
前記方法が、前記畳み込みニューラルネットワークを使用して、前記１つ以上の候補オブジェクトの第１の候補オブジェクトが単一の細胞であることを判定することを含み、
前記細胞群体が１つの細胞のみから形成されたかどうかを判定することが、前記ウェル内の前記第１の候補オブジェクトの位置を前記ウェル内の前記細胞群体の位置と比較することを更に含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の時系列画像が、前記第１の時間と前記第２の時間との間の第３の時間において生成された第３の時系列画像を更に含み、
前記方法が、前記畳み込みニューラルネットワークを使用して、前記１つ以上の候補オブジェクトの第１の候補オブジェクトが単一の細胞であることを判定することを含み、
前記細胞群体が１つの細胞のみから形成されたかどうかを判定することが、少なくとも前記第３の時系列画像を分析することによって、前記第１の候補オブジェクトが前記細胞群体に発達したかどうかを判定することを更に含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の候補オブジェクトが前記細胞群体に発達したかどうかを判定することが、前記第３の時系列画像が、（ｉ）前記細胞群体よりも少ない細胞数、又は（ｉｉ）前記細胞群体よりも小さいサイズ、の一方又は両方を有する中間細胞群体を示すかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の候補オブジェクトが前記細胞群体に発達したかどうかを判定することが、（ｉ）前記第３の時系列画像が前記中間細胞群体を示すことを判定することと、（ｉｉ）前記ウェル内の前記中間細胞群体の位置を、前記ウェル内の前記細胞群体の位置及び／又は前記ウェル内の前記第１の候補オブジェクトの位置と比較することと、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の画像化ユニットが、第１の倍率レベルで前記複数の時系列画像を生成し、
前記方法が、前記第１の時系列画像に示される前記１つ以上の候補オブジェクトのそれぞれに対して、前記第１の倍率レベルよりも大きい第２の倍率レベルを提供する第２の画像化ユニットによって、前記候補オブジェクトを含む前記ウェルの一部のズームイン画像を生成することを更に含み、
前記候補オブジェクトが単一の細胞であるかどうかを判定することが、前記畳み込みニューラルネットワークを使用して前記ズームイン画像を分析することによって、前記候補オブジェクトが単一の細胞であるかどうかを判定することを含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ズームイン画像を生成することが、前記ウェルが前記第２の画像化ユニットの光路と整列するように前記ウェルをシフトさせることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記候補オブジェクトが単一の細胞であるかどうかを判定することが、前記畳み込みニューラルネットワークを使用して前記候補オブジェクトを複数の可能なオブジェクトタイプのうちの１つとして分類することを含み、前記複数のオブジェクトタイプが単一の細胞に対応するタイプを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の時系列画像に示される前記細胞群体を検出することが、別の畳み込みニューラルネットワークを使用して前記第２の時系列画像を処理することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記細胞群体が１つの細胞のみから形成されたことを判定することを含み、
前記方法が、前記ウェルから新しい培養環境に細胞を輸送することと、前記新しい培養環境で前記細胞を培養することと、を更に含む、
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
２０１８年１１月３０日に出願され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／７７４，１５４号明細書に対する優先権が主張される。
続きを表示（約 4,300 文字）【０００２】
本出願は、一般に、クローン選択技術に関し、より具体的には、細胞群体が単一のクローン／細胞から形成されたかどうかを判定するための技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な細胞株開発プロセスでは、クローン選択には、細胞群体が単一のクローン細胞から形成されたかどうかの知識が必要である。例えば、個々の細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）技術などのフローサイトメトリー技術によって（例えば、９６ウェルプレートの）別々のウェルに接種され、その後、適切な期間（例えば１４日）にわたって細胞が培養され得る。培養期間を通して、ウェルのデジタル画像は、毎日、又は７日ごとなどの適切な時間間隔でキャプチャされる。分析者は、細胞群体を識別するために、培養期間の終わり（例えば、１４日目）にキャプチャされたウェル画像を確認し、特定のウェルに群体が含まれている場合、分析者はまた、同じウェルの１つ以上の以前の画像（例えば、培養の初日にキャプチャされた画像）を確認して、群体が単一のクローンのみから形成されたかどうかを判定することができる。群体が単一のクローンから形成されたことを分析者が確認できる場合、その特定のサンプルは、細胞株開発プロセスの１つ以上の追加ステージに転送され得る。もしそうでない場合、サンプルは廃棄され得る。
【０００４】
このプロセスには、非常に時間と手間がかかる。例えば、単一のプロジェクトに対して、顕微鏡画像の分析に数百人のマンアワーが必要になることは珍しくない。更に、群体の前駆細胞を識別しようと試みるときに、分析者がウェル内の単一の細胞を正確に識別することは困難な場合がある。例えば、画像化されたオブジェクトに焦点が合っていない場合、偽陽性が生じ得る（すなわち、オブジェクトを単一の細胞として誤ってラベル付けする）。別の例として、ダブレット又は「スタック」細胞は、単一の細胞と区別するのが難しい場合がある。偽陽性（及び／又は偽陰性）は、デブリ、ウェル壁によって作成された影、及び／又はウェル壁の内周上の異常などの他の要因からも生じ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載される実施形態は、クローン選択に使用される従来の目視検査技術を改善するシステム及び方法に関する。特に、いくつかの実施形態では、自動目視検査システムは、培養期間（例えば、数日又は数週間）にわたる間隔で、ウェルプレート内の各ウェルに対して、一連のデジタル画像をキャプチャする。実施形態に応じて、画像は、培養期間の初日及び最終日にのみ、毎日、又は他の適切なタイムスケジュールでキャプチャされ得る。システムは、単一の細胞に由来する候補オブジェクト群体を識別することができる。識別された候補オブジェクトに基づいて、システムは、更なる画像キャプチャのためにウェルの位置を移動することができる。単一の細胞に由来する群体を含むと識別されたウェルからの細胞は、新しい培養環境に移して培養され得る。本明細書で使用される場合、「ウェル」は、その内容物の光学的検査を可能にする任意の実験室規模の細胞培養環境を指す。マルチウェルプレート上のウェルが本明細書の例として論じられているが、「ウェル」及び「ウェルプレート」が言及されるときはいつも、特に明記しない限り、これらの用語は、その内容物の光学的検査を可能にする任意の適切な実験室規模の細胞培養環境を包含すると考えられることを理解されたい。
【０００６】
所与のウェルに対して、コンピュータ画像処理技術を後の画像（例えば、培養期間の最終日にキャプチャされた画像）に適用して、ウェルが細胞群体を含むかどうかを判定することができる。例えば、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を使用して、ウェル培地内のオブジェクトを細胞群体として分類することができる。ＣＮＮは、（例えば、画像内のエッジなどの特徴を検出するための）２次元畳み込みに適した任意の数の畳み込み層、プーリング層（例えば、特徴の相対位置を維持しながら計算を低減するためのダウンサンプリング層）、及び完全に接続された層を含み得る。或いは、従来の画像フィルタリング、エッジ検出、及び／又はパターン検出技術などの、１つ以上の他の画像処理技術を使用して、群体を検出することができる。細胞群体がウェル内で検出された場合、ウェルの１つ以上の以前の画像（例えば、培養の初日からの画像）を分析して、群体が単一のクローン／細胞から形成されたかどうかを判定することができる。この判定には、複数のステップが含まれ得る。まず、ウェル全体の画像を分析して、単一の細胞である候補となるウェル内の任意のオブジェクト（例えば、単一の細胞になるには大き過ぎることも小さ過ぎることもないオブジェクト）を識別する。次いで、各候補オブジェクトの画像が、オブジェクトタイプに従って候補オブジェクトを分類するＣＮＮ（例えば、第１のＣＮＮが細胞群体を検出するために使用された場合は第２のＣＮＮ）に入力される。いくつかの実施形態では、各候補オブジェクトの画像は、ウェル全体の画像から抽出され、且つ、その候補オブジェクトを示すピクセルのセットを含むか、又は単にピクセルのセットで構成されている。いくつかの実施形態では、各候補オブジェクトの画像は、例えば、現在利用可能な画像化技術に関連する画像解像度の制限を克服するために、候補オブジェクトのズームイン画像を更に含む。例えば、第１の、より低倍率の画像化ユニットを使用して、候補オブジェクトを識別する目的でウェル全体の画像をキャプチャすることができ、一方、第２の、より高倍率の画像化ユニットを使用して、識別された候補オブジェクトのそれぞれのズームイン画像をキャプチャすることができる。第２の画像化ユニットの使用には、例えば、ウェルプレートをｘ及び／又はｙ方向にわずかな距離だけシフトさせることによって、ウェル又はウェルの一部を第２の画像化ユニットの光路に配置することを更に含み得る。
【０００７】
所与の候補オブジェクトに対して、ＣＮＮは、二項分類（例えば、「単一の細胞」対「単一の細胞ではない」）を出力し得るか、又は３つ以上のタイプ（例えば、「単一の細胞」、「ダブレット」、「空の細胞」、「デブリ」など）のうちの１つに従ってオブジェクトを分類することができる。候補オブジェクトが単一の細胞（又は単一の生細胞に対応する別のクラス）として分類される場合、細胞群体は、その細胞に由来すると判定され得る。この判定はまた、ウェル内の検出された細胞群体の位置と比較したウェル内の単一の細胞の位置などの、１つ以上の他の要因にも依存し得る。更に、いくつかの実施形態では、培養期間中の１つ以上の他の時間に対応する、ウェルの１つ以上の追加の画像を分析して、細胞群体が単一の細胞から形成されたことを確認することができる。例えば、追加の画像を処理して、細胞群体の１つ以上の中間成長ステージを検出することができる。
【０００８】
細胞群体が単一の細胞から形成されたと判定できない場合、そのウェル内のサンプルは廃棄され得る。しかしながら、単一の細胞の起源を判定できる場合（例えば、９０％又は９９％などの、少なくともある程度の閾値レベルの精度で）、サンプルは、細胞株開発プロセスの１つ以上の追加ステージに転送され得る。例えば、（例えば、単一の細胞としての、及び／又は他の細胞も含み得る、細胞を含むサンプルの一部としての）サンプルの細胞は、新しい培養環境に転送されて培養され得る。細胞株は、実施形態に応じて、多種多様な目的のいずれかに対して使用することができる。例えば、細胞株は、バイオ医薬品の抗体又はハイブリッド分子（例えば、ＢＬＩＮＣＹＴＯ（登録商標）（ブリナツモマブ）などの二重特異性Ｔ細胞エンゲジャ（ＢｉＴＥ（登録商標））抗体を含む薬物、又はモノクローナル抗体など）を生成する細胞を提供するため、又は研究及び／若しくは開発目的で細胞を提供するために使用することができる。「精度」は、本開示を考慮して当業者によって理解されるであろうその通常の慣習的な意味を有する。それは、結果が偽陰性でも又は偽陽性でもない確率を指す。例えば、精度は、１００％－（タイプＩエラー）－（タイプＩＩエラー）として計算することができる。
【０００９】
当業者であれば、本明細書に記載される図は、説明の目的で含まれるものであり、本開示を限定するものではないことを理解するであろう。図面は必ずしも縮尺通りではなく、その代わりに、本開示の原理を示すことに重点が置かれている。いくつかの場合では、記載される実施形態の様々な態様は、記載される実施形態の理解を容易にするために、誇張又は拡大して示される場合があることが理解されよう。図面においては、様々な図面の全体を通じて、同一の参照符号は、一般に、機能的に類似した且つ／又は構造的に類似したコンポーネントを参照している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本明細書に記載される技術が実装され得る例示的なシステムの簡略化されたブロック図である。
図１のシステムで使用され得る例示的な目視検査システムを示している。
図１のシステムで使用され得る例示的な目視検査システムを示している。
図１のシステムで使用され得る例示的な目視検査システムを示している。
ウェルサンプルを使用するか又は廃棄するかを判定するための例示的なプロセスのフロー図である。
２つの異なる時間においてウェル画像が目視検査システムによって生成される例示的な実施形態及びシナリオを示している。
３つの異なる時間においてウェル画像が目視検査システムによって生成される例示的な実施形態及びシナリオを示している。
ウェル画像で複数の候補オブジェクトが識別されている実施形態及びシナリオを示している。
候補オブジェクトの例示的なズームイン画像を示している。
クローン選択を容易にするための例示的な方法のフロー図である。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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