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公開番号2025013534
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2024194504,2022190666
出願日2024-11-06,2018-03-28
発明の名称コラゲナーゼ産生の改良された方法
出願人エンドベンチャーズアンリミテッドカンパニー
代理人個人
主分類A61K 38/46 20060101AFI20250117BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】コラゲナーゼ産生の改良された方法を提供すること。
【解決手段】単離され、かつ精製されたコラゲナーゼを含む薬物製品であって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、薬物製品。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
単離され、かつ精製されたコラゲナーゼを含む薬物製品であって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、薬物製品。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／４７７，８４６号の優先権を主張し、これは、法により許容される最大範囲までその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,100 文字）【０００２】
本発明は、コラゲナーゼ産生およびコラゲナーゼ製品の分野、特にコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ組成物の再現性、純度、および安定性の改良に関し、組成物は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、かつ中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ．ヒストリチクムの発酵から高度に純粋な（少なくとも９５％純粋な）コラゲナーゼを製造するためのプロセスが、特許文献１で以前に記載されている。コラゲナーゼＩおよびＩＩは、哺乳動物中に最も豊富にある構造タンパク質であるコラーゲンを分解する酵素である。これらの酵素は、さまざまなコラーゲン介在疾患、例えば、デュプイトラン拘縮、ペロニー病、脂肪腫、および癒着性関節包炎の治療のために使用される。特許文献２および特許文献３は、デュプイトラン病の治療におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示している。特許文献４は、ペロニー病の治療におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示している。特許文献５および特許文献６は、脂肪腫の治療におけるコラゲナーゼの使用を開示している。特許文献７は、癒着性関節包炎の治療におけるコラゲナーゼの使用を開示している。特許文献８および特許文献９は、セルライトを治療するためのコラゲナーゼの使用を開示している。
【０００４】
コラゲナーゼの主な供給源は、Ｃ．ヒストリチクムの発酵からである。Ｃ．ヒストリチクムコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む注射用製剤は、商標名ＸＩＡＦＬＥＸ（登録商標）の下で販売されており、デュプイトラン拘縮およびペロニー病の治療のために米国食品医薬品局から認可されている。注射用製剤は、欧州および他の国では、ＸＩＡＰＥＸ（登録商標）と呼ばれている。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについてのアミノ酸配列は、それぞれｃｏｌＧおよびｃｏｌＨ遺伝子によりコードされている。ｃｏｌＧについてのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ８７２１５および非特許文献１に記載されており、ｃｏｌＨについてのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１および非特許文献２に記載されている。コラゲナーゼＡＵＸＩは、約１１３ｋＤａの分子量を有するおおよそ１０００個のアミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を有する。コラゲナーゼＡＵＸＩＩも、約１１２ｋＤａの分子量を有するおおよそ１０００個のアミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を有する。
【０００５】
コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、金属プロテアーゼであり、その活性のために固く結合した亜鉛および緩く結合したカルシウムを必要とする（非特許文献３）。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの両方は、コラーゲンのすべての型に対して幅広い特異性を有する（非特許文献４）。これらのコラゲナーゼは、生理的条件下でコラーゲンの三重らせん領域を加水分解することにより、コラーゲンを消化する（非特許文献４）。各コラゲナーゼは異なる特異性を示すが（すなわち、各々は切断のために異なる好ましいアミノ酸配列を有する）、併せて、それらはコラーゲンに対して相乗的な活性を有する（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
療法において使用するためのコラゲナーゼは、哺乳動物、真菌類、および細菌供給源を含むさまざまな供給源から得られる場合がある。粗コラゲナーゼの１つの一般的供給源は、細菌の発酵プロセスから、具体的には、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｃ．ヒストリチクム）の発酵からである。Ｃ．ヒストリチクムから得られた粗コラゲナーゼは、多数のクロマトグラフィー技法のいずれかを用いて精製され得る。しかし、さまざまな毒素を含む、コラゲナーゼ以外の多くの他の酵素が、発酵液の中へと分泌される。
【０００７】
特許文献１０で以前に記載されているように、コラゲナーゼを産生する発酵中のこれらの毒素の機能を調査するために、Ｃ．ヒストリチクム００４株から分泌された毒素のゲノム配列決定および分析を実施した。調査した毒素は、アルファ毒素（致死因子）、ベータ毒素（Ｉ型およびＩＩ型コラゲナーゼ）、ガンマ毒素（クロストリパイン）、デルタ毒素（中性プロテアーゼ）、イプシロン毒素（酸素不安定性ヘモリジン）であった。ゲノム配列分析に基づいて、コラゲナーゼおよびクロストリパインのみが、００４株の機能的毒素であると考えられた。他の毒素は、Ｃ．ヒストリチクムタンパク質と各モデルタンパク質との間の必須アミノ酸配列の差異に基づいて、非機能的であると考えられた。
【０００８】
中性プロテアーゼ（ＮＰ）とも知られているデルタ毒素は、Ｃ．ヒストリチクムからの金属プロテアーゼである。中性プロテアーゼは、金属プロテアーゼのＭ４ファミリーのメンバーであり、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼデータベースによれば、中性プロテアーゼは、共通配列モチーフ、基質特異性、およびコファクター要件を含む、Ｍ４ファミリーと構造的類似性を有する。テルモリシンは、Ｍ４ファミリーのうち、最も研究され、かつ理解されている酵素である。この研究に関連して、バチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からのテルモリシンが以前クローニングされ、かつ配列決定され、そしてその情報は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＣＡＡ５４２９１として登録された。テルモリシンは、３４．６ｋＤａの成熟酵素分子量を有する亜鉛金属プロテアーゼである。テルモリシンおよびＭ４ペプチドファミリーのすべてのメンバーは、シグナルペプチド、プロ配列、および成熟配列から構成される。
【０００９】
テルモリシンが細胞により産生される場合、これは、成熟酵素配列の前にあるタンパク質プロ配列がテルモリシンを阻害するため、不活性酵素（プロ酵素）として開始する。プロ配列は、分泌されたプロ酵素の大きさの３分の２を表し、一方で成熟酵素は、３分の１を表す。テルモリシン中のプロ配列は、自己触媒的に切断され、その目的とする環境において成熟酵素の活性化をもたらす。テルモリシン分泌ストラテジーは、中性プロテアーゼと共有され、Ｃ．ヒストリチクム中性プロテアーゼがまた不活性プロテアーゼとして開始することを結論付けるための根拠であった。同様に、その成熟形態でのＣ．ヒストリチクム中性プロテアーゼは、Ｈｅｒｂｅｒ（特許文献１０）および非特許文献７において記載されているように、テルモリシンと同様の分子量を有する。
【００１０】
その合成、分泌、活性化、および基質特異性におけるテルモリシンの類似性により、テルモリシンは、Ｃ．ヒストリチクム００４株からの中性プロテアーゼのためのモデルとなる。テルモリシンと中性プロテアーゼとの間のこれらの特質は、共有された構造的特徴に基づいて類似しているが、２つの酵素の間には、配列差異が存在する。本発明に関連して、Ｈｅｒｂｅｒ（特許文献１０）における、デルタ毒素の以前のゲノム分析およびテルモリシンに対するホモロジー比較は、中性プロテアーゼは成長培地中に分泌された可能性があるが、自己触媒部位における異なるコンセンサス配列に起因して活性でなかったことを結論付けた。
（【００１１】以降は省略されています）

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