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公開番号2025012988
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-24
出願番号2023116222
出願日2023-07-14
発明の名称色素沈着を調節された皮膚モデル、皮膚モデルの製造方法、シミ色素沈着予防、軽減、改善又は治療剤のスクリーニング方法、ケラチノサイト培養用の細胞外マトリクスタンパク質ゲル及びその製造方法
出願人株式会社資生堂,国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250117BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】色素沈着を調節された皮膚モデルを提供することを目的とする。
【解決手段】メラニンの蓄積が基底膜の凹凸構造により影響されること、さらにはメラニン合成が基底膜を模した細胞外マトリクスタンパク質ゲルの硬さにより影響されることを見出し、基底膜を模した細胞外マトリクスタンパク質ゲルの硬度パラメータ及び凹凸パラメータを調整することで、色素沈着を調節された皮膚モデルを提供した。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルと、当該ゲル上に播種されたケラチノサイトと、さらにメラノソーム又は播種されたメラノサイトとを含む、色素沈着を調節された皮膚モデル。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
色素沈着が、ケラチノサイトにより取り込まれたメラノソームが、核周り及び／又は細胞質及び細胞膜周辺に局在することにより調節される、請求項１に記載の皮膚モデル。
【請求項３】
前記凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルが、所定の凹凸パラメータを有するモールドから転写されたゲルである、請求項１に記載の皮膚モデル。
【請求項４】
前記凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルは、タンパク質水溶液又は物理ゲルに対して所定の凹凸パラメータを有するモールドが接した状態で、量子ビームを照射して硬化し、モールドから剥離することにより製造されたゲルである、請求項２に記載の皮膚モデル。
【請求項５】
前記色素沈着を調節された皮膚モデルが、細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸表面の凹凸パラメータ及び細胞外マトリクスタンパク質ゲルの硬度パラメータが、前記細胞を前記ゲルと培養して得られる細胞培養物における所定のメラニン分布及び／又はメラニン合成に合わせて調整される、請求項１に記載の皮膚モデル。
【請求項６】
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸パラメータが、０μｍ以上かつ２００μｍ以下の凹凸深さ、０μｍ以上かつ１５００μｍ以下の凹凸幅となるように前記タンパク質が調製される、請求項５に記載の皮膚モデル。
【請求項７】
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸パラメータが、サンドペーパーの粗さ（粒度）の番手＃１２以上かつ＃２０００以下（JIS R 6010に準拠）の表面粗さを有するモールドに対し細胞外マトリクスタンパク質ゲルを転写させた凹凸表面において達成される、請求項５に記載の皮膚モデル。
【請求項８】
色素沈着箇所と非色素沈着箇所との比較研究のための、請求項１に記載の皮膚モデル。
【請求項９】
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルの硬度パラメータが、静的試験法、横振動法、超音波法、レオメーター、ナノ・マイクロインデンテーション法、及びコヒーレンスエラストグラフィ(ＯＣＥ)から選ばれるいずれかの手法で測定した場合に０．５ｋＰａ以上かつ２００ｋＰａ以下の硬さとなるように前記タンパク質が調製される、請求項１に記載の皮膚モデル。
【請求項１０】
皮膚モデルの製造方法であって、
細胞外マトリクスタンパク質ゲル調製用水溶液もしくは物理ゲルに対し、サンドペーパーの粗さ（粒度）の番手＃１２～＃２０００（JIS R 6010に準拠）の表面粗さを有するモールドを積層して積層体を取得する工程；
前記積層体に、５～５０ｋＧｙの量子ビームを照射する工程；
照射後の積層体から前記モールドを除去し、凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルを取得する工程；
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や培地等に浸漬して、３７℃でインキュベートし、未架橋成分を除去する工程；
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲル上にケラチノサイトを播種するとともに、メラノソームやメラニンを添加するか又はメラノサイトを播種する工程；
細胞を培地中で培養する工程；及び
細胞を気相に晒して培養する工程
を含む、前記製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素沈着を調節された皮膚モデル、及びその製造方法、並びにその利用に関する。
続きを表示（約 5,200 文字）【背景技術】
【０００２】
皮膚の解析には細胞培養試験や動物試験が行われてきた。皮膚は複数の細胞が複雑高度な構造をとることから、細胞間の相互作用や連携などを研究するためには、細胞培養試験のみでは十分とは言えなかった。また、生きた動物を利用する動物試験は、アニマルウェルフェアの観点から問題となっており、動物を利用しない新たな研究手法として、培養皮膚モデルを用いた解析が行われている。
【０００３】
皮膚の構造を模して構成された皮膚モデルは、皮膚研究の重要なツールとなっている。皮膚モデルは、皮膚の生理機能の解明、スキンケア製品の性能評価、有効成分の探索など様々な目的で使用されている。皮膚モデルにおいて表皮層を形成するためには、表皮ケラチノサイトを培養後、表皮層の角層側を気相へ暴露することにより分化誘導させて、基底層、有棘層、顆粒層、及び角層を形成させることが必要である。皮膚モデルは、ケラチノサイトの培養により形成された表皮層のみを形成させた表皮モデルと、真皮線維芽細胞の培養により形成された真皮層上にケラチノサイトを培養して表皮層を形成させた皮膚モデルとに大別される。培養皮膚モデルには、ケラチノサイトや真皮線維芽細胞とは別に、さらに表皮層又は真皮層に含まれる様々な細胞、例えばメラノサイトや、真皮下の皮下脂肪層の脂肪細胞がさらに配置されるように調製することができる(特許文献１：特開２０１０－１９３８２２号公報、特許文献２：特開２０１２－２３５９２１号公報)。さらに、培養皮膚モデルの厚さを提供するために、基底部に凹凸を形成することなどが行われている（特許文献３：国際公開第２０１７／２２２０６５号）。
【０００４】
従来の皮膚モデルは、平板や基板上に足場となる細胞外マトリクス成分をコーティングし、その上に細胞を播種し、増殖、分化及び／又は成熟させることで調製されてきた。このようにして調製された皮膚モデルは、皮膚構造をある程度模していたが、基底膜直下の凹凸を十分に再現するには至っていなかった。これら凹凸構造は、通常規則的な凹凸の深さや間隔であり、表皮のホメオスタシスである表皮幹細胞維持や増殖、角層の正常な分化からバリア機能にいたる過程に重要であることが示唆されている（非特許文献１：Am J Physiol Cell Physiol. 2022 Dec 1;323(6):C1807-C1822、非特許文献２：Development. 2020 Nov 15;147(22):dev194100.）。
【０００５】
一方、シミ部位においても上記のような凹凸構造があり乳頭層隆起(rete ridge)と呼ばれている。このシミにおける凹凸構造は通常の凹凸構造より深くかつ凹凸間隔が不規則である点がシミを特徴づける病変として知られている。さらに、基底層直下の固さも表皮細胞の基底膜における維持や細胞増殖、表皮の肥厚といった表皮のホメオスタシスに重要であるとされている。そのような基底膜直下の固さを模した皮膚モデルも構築されている（非特許文献３：J Cell Sci. 2018 May 16;131(10):jcs215780、非特許文献４：Nature Aging volume 2, pages592-600 (2022)）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特開２０１０－１９３８２２号公報
特開２０１２－２３５９２１号公報
国際公開第２０１７／２２２０６５号
【非特許文献】
【０００７】
Am J Physiol Cell Physiol. 2022 Dec 1;323(6):C1807-C1822
Development. 2020 Nov 15;147(22):dev194100.
J Cell Sci. 2018 May 16;131(10):jcs215780.
Nature Aging volume 2, pages592-600 (2022)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
シミの乳頭層隆起がシミ部位におけるメラニン蓄積やメラノサイトのメラニン合成能の亢進に関与することが本発明者らにより予測されたが、その関係やメカニズムについては不明なままであった。
また、シミにおける色素沈着やメラニン生成への影響を乳頭層隆起構造とあわせて検証しかつ確立したモデルは未だ開発されていない。
シミなどの色素沈着現象における上記課題を解決するうえで、皮膚モデルにおいて基底膜直下の凹凸構造のパラメータ制御(深さ、間隔)および固さ(硬度)の両方の調節が必要になる。そこで、本発明は、凹凸深さ・間隔および硬度が調節された皮膚モデルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、シミなどの色素沈着を調節された皮膚モデルにおいては、基底膜直下の凹凸箇所を模擬する必要性があることに着想し、皮膚モデルを製造するにあたり、所定の凹凸表面及びゲル硬度を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルを用いた皮膚モデルを調製した。すると、皮膚モデルにおいて、基底膜直下を模した細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸深さおよび凹凸間隔(ピッチ)の違い(以下、凹凸の粒度とする)により、ケラチノサイトに供与されたメラノソームの分布が変化することを見出した。さらに、ゲル硬度が低いほど、メラニン合成が促進されることを見出した。
【００１０】
これらの新規知見に基づいて、細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸の粒度及びゲル硬度を制御することで、メラノソームのケラチノサイト内での分布の違い及びメラニン産生量を調節し、色素沈着を調節された皮膚モデルを提供することが可能になり、本発明に至った。
そこで、本発明は以下に関する：
［１］凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルと、当該ゲル上に播種されたケラチノサイトと、さらにメラノソーム又は播種されたメラノサイトとを含む、色素沈着を調節された皮膚モデル。
［２］色素沈着が、ケラチノサイトにより取り込まれたメラノソームが、核周り及び／又は細胞質および細胞膜周辺に局在することにより調節される、項目１に記載の皮膚モデル。
［３］前記凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルが、所定の凹凸パラメータを有するモールドから転写されたゲルである、項目１又は２に記載の皮膚モデル。
［４］前記凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルが、タンパク質水溶液もしくは物理ゲルに対して所定の凹凸パラメータを有するモールドが接した状態でで、量子ビームを照射して硬化し、モールドから剥離することにより製造されたゲルである、項目３に記載の皮膚モデル。
［５］前記色素沈着を調節された皮膚モデルが、細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸表面の凹凸パラメータ及び細胞外マトリクスタンパク質ゲルの硬度パラメータが、前記細胞を前記ゲルと培養して得られる細胞培養物における所定のメラニン分布及び／又はメラニン合成に合わせて調整される、項目１～４のいずれか一項に記載の皮膚モデル。
［６］前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸パラメータが、０～２００μｍの凹凸深さ、０～１５００μｍの凹凸幅となるように前記タンパク質が調製される、項目５に記載の皮膚モデル。
［７］前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルの凹凸パラメータが、サンドペーパーの粗さ（粒度）の番手＃１２～＃２０００（JIS R 6010に準拠）の表面粗さを有するモールドに対し細胞外マトリクスタンパク質ゲルを転写させた凹凸表面において達成される、項目５に記載の皮膚モデル。
［８］色素沈着箇所と非色素沈着箇所との比較研究のための、項目１～７のいずれか一項に記載の皮膚モデル。
［９］前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルの硬度パラメータが、静的試験法、横振動法、超音波法、レオメーター、ナノ・マイクロインデンテーション法、コヒーレンスエラストグラフィ(ＯＣＥ)のいずれかで測定した場合に０．５ｋＰａ～２００ｋＰａとなる硬さとなるように前記タンパク質が調製される、項目１～８のいずれか一項に記載の皮膚モデル。
［１０］皮膚モデルの製造方法であって、
細胞外マトリクスタンパク質水溶液もしくは物理ゲルに対し、サンドペーパーの粗さ（粒度）の番手＃１２～＃２０００（JIS R 6010に準拠）の表面粗さを有するモールドを積層して積層体を取得する工程；
前記積層体に、５～５０ｋＧｙの量子ビームを照射する工程；
照射後の積層体から前記モールドを除去し、凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルを取得する工程；
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や培地等に浸漬して、３７℃でインキュベートし、未架橋成分を除去する工程；
前記細胞外マトリクスタンパク質ゲル上にケラチノサイトを播種するとともに、メラノソームやメラニンを添加するか又はメラノサイトを播種する工程；
細胞を培地中で培養する工程；及び
細胞を気相に晒して培養する工程
を含む、前記製造方法。
［１１］項目１０に記載の製造方法により調製された皮膚モデル。
［１２］色素沈着予防、軽減、改善又は治療剤のスクリーニング方法であって、
項目１～９及び１１に記載の皮膚モデルを、候補成分を含む培地中で培養する工程；
ケラチノサイトにおけるメラニン蓄積位置を特定する工程；
候補成分を含まない対照培地で培養された皮膚モデルのケラチノサイトにおけるメラニン蓄積位置と比較し、蓄積位置の変化をもたらす候補成分を色素沈着予防、軽減、改善又は治療剤として選択する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
［１３］色素沈着予防、軽減、改善又は治療剤のスクリーニング方法であって、
項目１～９及び１１に記載の皮膚モデルにおいて播種されたメラノサイトを、試験薬物を含む培地中で培養する工程；
メラノサイトにおけるメラニン合成指標を特定する工程；
候補成分を含まない対照培地で培養された皮膚モデルのメラノサイトにおけるメラニン合成指標と比較し、メラニン合成指標がメラニン合成の減少を示す候補成分を色素沈着予防、軽減、改善又は治療剤として選択する工程
を含む、前記スクリーニング方法。
［１４］前記メラニン合成指標がメラニン量である、項目１３に記載のスクリーング方法。
［１５］前記メラニン合成指標が、メラニン合成関連遺伝子のタンパク質量又は発現量である、項目１３に記載のスクリーニング方法。
［１６］前記メラニン合成関連遺伝子が、ＭＬＡＮＡ、ＰＭＥＬ．ＴＹＲ，ＤＣＴ及びＴＲＰ１からなる群から選択される、項目１７に記載のスクリーニング方法。
［１７］前記メラニン合成指標と相関してデンドライトの数や長さが増大することでメラノサイトのメラニン生成細胞としての活性化状態を指標とする、項目１３に記載のスクリーニング方法。
［１８］前記メラニン合成指標と相関してメラノサイトからメラニンをケラチノサイトへ受け渡しが増大することでメラノサイトのメラニン輸送能としての活性化状態を指標とし、メラニン輸送能の指標がＭＲＥＧ、及びＭＬＰＨからなるメラニン輸送関連遺伝子群のタンパク質量又は発現量である、項目１３に記載のスクリーニング方法。
［１９］ケラチノサイト培養用の細胞外マトリクスタンパク質ゲルの製造方法であって、
細胞外マトリクスタンパク質水溶液もしくは物理ゲルに対し、サンドペーパーの粗さ（粒度）の番手＃１２～＃２０００（JIS R 6010に準拠）の表面粗さを有するモールドを積層して積層体を取得する工程；
前記積層体に、５～５０ｋＧｙの量子ビームを照射する工程；
照射後の積層体から前記モールドを除去し、凹凸表面を有する細胞外マトリクスタンパク質ゲルを取得する工程；
を含む、前記製造方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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