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公開番号2025005450
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-16
出願番号2024175879,2023558098
出願日2024-10-07,2022-11-07
発明の名称ベータコロナウイルス弱毒株
出願人一般財団法人阪大微生物病研究会
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 7/04 20060101AFI20250106BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】新たなベータコロナウイルスワクチンとして有用なベータコロナウイルス弱毒株を提供する。
【解決手段】温度感受性に関する所定の置換変異と、弱毒化に関する所定の欠失変異とを組み合わせで有する新規のベータコロナウイルスが、弱毒性に優れたベータコロナウイルスのワクチン株として有用であることを見出した。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、並びに／若しくは（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
以下の（ｎ）、（о）及び／又は（ｒ）の変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、
を含む、ベータコロナウイルス弱毒株：
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｎ）ＯＲＦ８の機能欠失変異、
（о）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８１位～第６８４位に相当するアミノ酸配列の欠失、
（ｒ）ＮＳＰ１における、配列番号８に示すアミノ酸配列の第３２位～第３９位に相当するアミノ酸配列の欠失。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異、前記（ｎ）の変異、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異の６種の変異又は変異の組み合わせのうち、４種の変異又は変異の組み合わせが選択される、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項３】
前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異の３種の変異又は変異の組み合わせのうち、１～２種の変異又は変異の組み合わせが選択される、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項４】
前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び前記（ｆ）の変異の組み合わせ、並びに／若しくは前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
前記（о）の変異及び／又は前記（ｒ）の変異を有する構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項５】
前記（ｅ）及び前記（ｆ）の変異の組み合わせを有する非構造タンパク質と、
前記（ｎ）の変異、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び非構造タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項６】
前記（ｅ）及び前記（ｆ）の変異の組み合わせ、及び前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
前記（ｎ）の変異、及び前記（о）の変異を有する構造タンパク質及び付属タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項７】
前記（ｅ）及び前記（ｆ）の変異の組み合わせ、及び前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
前記（ｎ）の変異、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び非構造タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項８】
前記（ｂ）の変異、及び前記（ｅ）及び前記（ｆ）の変異の組み合わせを有する非構造タンパク質と、
前記（ｎ）の変異、及び前記（о）の変異を有する構造タンパク質及び付属タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項９】
前記（ｂ）の変異、及び前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
前記（ｎ）の変異、及び前記（о）の変異を有する構造タンパク質及び付属タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
【請求項１０】
前記（ｅ）及び前記（ｆ）の変異の組み合わせ、及び前記（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
前記（ｎ）の変異、及び前記（ｒ）の変異を有する付属タンパク質及び非構造タンパク質と、
を含む、請求項１に記載のウイルス弱毒株。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベータコロナウイルス弱毒株に関する。
続きを表示（約 5,300 文字）【背景技術】
【０００２】
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）はパンデミックを引き起こし、今なお社会的な問題となっている。本感染症に対するワクチンとしては、ロシアで承認されたアデノウイルスベクターワクチンであるスプートニクＶ（非特許文献１）を皮切りとして、アデノウイルスベクターワクチン及びｍＲＮＡワクチンといった遺伝子ワクチンが承認され、世界中で接種が進められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
THE LANCET, VOLUME 396, ISSUE 10255, P887-897,SEPTEMBER 26,2020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、遺伝子ワクチンは従来型のワクチンとは異なる次世代型のワクチンであり、発熱及び血栓症等の副反応が報告されている。このため、引き続き新たなワクチン開発は重要だと考えられる。
【０００５】
そこで本発明は、新たなベータコロナウイルスワクチンとして有用な株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果、弱毒性に関する所定の変異として、温度感受性に関する所定の置換変異と、増殖低減性その他の弱毒性に関する所定の欠失変異とを組み合わせて有する新規のベータコロナウイルスが、弱毒性に優れたベータコロナウイルスのワクチン株として有用であることを見出した。本発明は、この知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成された発明である。すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。
【０００７】
項１．以下の（ｂ）の変異、（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、並びに／若しくは（ｈ）の変異を有する非構造タンパク質と、
以下の（ｎ）、（о）及び／又は（ｒ）の変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、
を含む、ベータコロナウイルス弱毒株：
（ｂ）ＮＳＰ３における、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４４５位のロイシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｅ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第２４８位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｆ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第４１６位のグリシンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｈ）ＮＳＰ１６における、配列番号３に示すアミノ酸配列の第６７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異、
（ｎ）ＯＲＦ８の機能欠失変異、
（о）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８１位～第６８４位に相当するアミノ酸配列の欠失、
（ｒ）ＮＳＰ１における、配列番号８に示すアミノ酸配列の第３２位～第３９位に相当するアミノ酸配列の欠失。
項２．前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異、前記（ｎ）の変異、前記（о）の変異、及び前記（ｒ）の変異の６種の変異又は変異の組み合わせのうち、４種の変異又は変異の組み合わせが選択される、項１に記載のウイルス弱毒株。
項３．前記（ｂ）の変異、前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせ、前記（ｈ）の変異の３種の変異又は変異の組み合わせのうち、１～２種の変異又は変異の組み合わせが選択される、項１又は２に記載のウイルス弱毒株。
項４．前記構造タンパク質がさらに以下の（ｐ）及び／又は（ｑ）の変異を含む、項１～３のいずれかに記載のウイルス弱毒株：
（ｐ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６７９位～第６８０位及び第６８５～６８６位に相当するアミノ酸配列の欠失を含む変異、
（ｑ）スパイクにおける、配列番号４に示すアミノ酸配列の第６８７位のバリンに相当するアミノ酸残基の変異。
項５．前記（ｅ）及び（ｆ）の変異の組み合わせと以下の（ｇ）の変異とを含む、項４に記載のウイルス弱毒株：
（ｇ）ＮＳＰ１４における、配列番号２に示すアミノ酸配列の第５０４位のアラニンに相当するアミノ酸残基の変異。
項６．前記（ｎ）の変異が、配列番号７に示す塩基配列にコードされるアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の欠失である、項４又は５に記載のベータコロナウイルス弱毒株。
項７．前記（ｂ）の変異がフェニルアラニンへの置換であり、前記（ｅ）の変異がバリンへの置換であり、前記（ｆ）の変異がセリンへの置換であり、前記（ｈ）の変異がイソロイシンへの置換である、項１～６のいずれかに記載のウイルス弱毒株。
項８．前記（ｑ）の変異がイソロイシンへの置換である、項４～７のいずれかに記載のウイルス弱毒株。
項９．前記ベータコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、項１～８のいずれかに記載のウイルス弱毒株。
項１０．項１～９のいずれかに記載のウイルス弱毒株を含む、弱毒生ワクチン。
項１１．経鼻投与される、項１０に記載の弱毒生ワクチン。
項１２．筋肉内投与、皮下投与又は皮内投与される、項１０に記載の弱毒生ワクチン。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新たなベータコロナウイルスワクチンとして有用な株が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化方法を示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性の確認結果（ＣＰＥ像）を示す。
各々のウイルス株の変異解析結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）における変異を導入した組換えウイルスの温度感受性の確認結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）における変異を導入した組換えウイルスの温度感受性の確認結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の増殖性解析結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）の増殖性解析結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの体重変動を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの体重変動を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺内又は鼻腔洗浄液のウイルス量を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺画像を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺組織学的解析結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染ハムスターの肺組織学的解析（HE染色及びIHC染色）を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）再感染ハムスターの体重変動を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染後ハムスターの体重変動を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］）感染後回復ハムスター血清の中和抗体価を示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の温度感受性化方法（Ｇ～Ｌ５０シリーズ［実施例］）を示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｇ～Ｌ５０シリーズ［実施例］）の温度感受性の確認結果（ＣＰＥ像）を示す。
追加分離株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）の変異解析結果を示す。
温度感受性株（Ｈ５０－１１［実施例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。
温度感受性株（Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）の復帰変異の可能性がある株によるＣＰＥ像を示す。
温度感受性株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）に関連して見出された塩基配列の欠失を示す。
図１７で示した塩基配列の欠失及びそれにコードされるアミノ酸配列の欠失の概要図を示す。
温度感受性株（Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）の増殖性解析結果を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染ハムスターの体重変動を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染ハムスターの肺重量を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染ハムスターの肺内又は鼻腔洗浄液のウイルス量を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）再感染ハムスターの体重変動を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８［参考例］、及び、Ｈ５０－１１、Ｌ５０－３３、Ｌ５０－４０［実施例］）感染後ハムスター血清の中和抗体価を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の投与経路による免疫誘導能の比較を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の投与量による免疫誘導能の比較を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。
温度感受性株（Ａ５０－１８株［参考例］）の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和活性評価を示す。
ワクチン候補株１～７［実施例］作出後、回復培養時のＣＰＥ像を示す。
ワクチン候補株１～７［実施例］の温度感受性評価を示す。
ｒＴｓ－ａｌｌ株［実施例］の温度感受性評価を示す。
ワクチン候補株１，３，４，６，７［実施例］の低力価、低用量投与時の中和抗体誘導能を示す。
ワクチン候補株７［実施例］の低力価、低用量投与免疫後の感染防御試験の結果を示す。
ワクチン候補株２，５［実施例］の高力価、高用量投与時の中和抗体誘導能を示す。
ワクチン候補株２［実施例］の各温度における増殖性評価を示す。
ワクチン候補株２［実施例］の投与により誘導された液性免疫の持続性試験結果を示す。
ワクチン候補株２［実施例］の投与による感染防御試験結果（感染ハムスターの体重変動）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］のｉｎｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討結果（ＣＰＥ有無）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］のｉｎｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討結果（各鼻腔洗浄液から抽出したウイルスＲＮＡの配列）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］のｉｎｖｉｖｏ継代時における毒力復帰検討結果（体重変動）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（鼻腔ｌｅｖｅｌ１）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（鼻腔ｌｅｖｅｌ２）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（鼻腔ｌｅｖｅｌ３）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］による組織障害性評価（肺）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］の投与により誘導された中和抗体価を示す。
ワクチン候補株２［実施例］の投与による感染防御試験結果（感染ハムスターの体重変動）を示す。
ワクチン候補株２［実施例］の投与により誘導された中和抗体価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．ベータコロナウイルス弱毒株
本発明のベータコロナウイルス弱毒株は、弱毒性に関する所定の変異として、温度感受性に関する所定の置換変異を有する非構造タンパク質と、増殖低減性その他の弱毒性に関する所定の欠失変異を有する構造タンパク質、付属タンパク質及び／又は非構造タンパク質と、を組み合わせで有するベータコロナウイルスであることを特徴とする。以下において、温度感受性に関する所定の置換変異を「温度感受性変異」とも記載し、増殖低減性に関する所定の欠失変異を「増殖低減性変異」とも記載し、増殖低減性変異以外の所定の欠失変異を「他の弱毒性変異」とも記載する。
（【００１１】以降は省略されています）

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