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公開番号2024179801
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-26
出願番号2023098941
出願日2023-06-16
発明の名称カルボン酸を原因とするにおいの抑制剤の評価及び/又は選択方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類G01N 33/566 20060101AFI20241219BHJP(測定;試験)
要約【課題】カルボン酸を原因とするにおいを選択的に抑制することができる物質の探索。
【解決手段】試験物質添加後のOR52E6、OR56B4、OR52B2、OR52R1、OR51M1、OR51G2及びこれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することを含む、カルボン酸を原因とするにおいの抑制剤の評価及び/又は選択方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
試験物質添加後のＯＲ５２Ｅ６、ＯＲ５６Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｒ１、ＯＲ５１Ｍ１、ＯＲ５１Ｇ２及びこれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することを含む、カルボン酸を原因とするにおいの抑制剤の評価及び／又は選択方法。
続きを表示（約 3,400 文字）【請求項２】
前記カルボン酸が酪酸、イソ酪酸、３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸及びノナン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記カルボン酸が、前記嗅覚受容体ポリペプチドがＯＲ５２Ｅ６又はこれと同等の機能を有するポリペプチドである場合に３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸であり、ＯＲ５６Ｂ４、ＯＲ５２Ｒ１又はこれらと同等の機能を有するポリペプチドである場合にノナン酸であり、ＯＲ５２Ｂ２又はこれと同等の機能を有するポリペプチドである場合にイソ酪酸であり、ＯＲ５１Ｍ１又はこれと同等の機能を有するポリペプチドである場合に酪酸及びイソ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種であり、ＯＲ５１Ｇ２又はこれと同等の機能を有するポリペプチドである場合に酪酸である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＲ５２Ｅ６が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ＯＲ５６Ｂ４が配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ＯＲ５２Ｂ２が配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ＯＲ５２Ｒ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ＯＲ５１Ｍ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、前記ＯＲ５１Ｇ２が配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＲ５２Ｅ６と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５６Ｂ４と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつノナン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５２Ｂ２と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ酪酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５２Ｒ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつノナン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｍ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酪酸及びイソ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｇ２と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酪酸に応答性を有するポリペプチドである、
請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ＯＲ５２Ｅ６と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１で示されるアミノ酸配列の下記表１の（１）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（２）のアミノ酸残基を有し、かつ３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５６Ｂ４と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号４で示されるアミノ酸配列の下記表１の（３）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（４）のアミノ酸残基を有し、かつノナン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５２Ｂ２と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の下記表１の（５）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（６）のアミノ酸残基を有し、かつイソ酪酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５２Ｒ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の下記表１の（７）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（８）のアミノ酸残基を有し、かつノナン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｍ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１３で示されるアミノ酸配列の下記表１の（９）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（１０）のアミノ酸残基を有し、かつ酪酸及びイソ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｇ２と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１６で示されるアミノ酸配列の下記表２の（１）の各アミノ酸位置に相当する位置の少なくとも１箇所に（２）のアミノ酸残基を有し、かつ酪酸に応答性を有するポリペプチドである、
請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
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【請求項７】
前記ＯＲ５２Ｅ６と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５６Ｂ４と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつノナン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５２Ｂ２と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソ酪酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５２Ｒ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつノナン酸に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｍ１と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酪酸及びイソ酪酸からなる群より選択される少なくとも１種に応答性を有するポリペプチドであり、
前記ＯＲ５１Ｇ２と同等の機能を有するポリペプチドが、配列番号１８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酪酸に応答性を有するポリペプチドである、
請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加すること、及び
該試験物質に対する該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること、
を含む、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記試験物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を増強する試験物質を、カルボン酸を原因とするにおいの抑制剤として選択することをさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
対照群における前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定することをさらに含む、請求項８記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明はカルボン酸を原因とするにおいを抑制する香料素材を探索する方法に関する。
続きを表示（約 3,900 文字）【背景技術】
【０００２】
我々の生活環境には、極性や分子量が異なる多数の悪臭分子が存在し、カルボン酸もその１種である。カルボン酸には、体臭、腋臭、靴臭、排便臭、料理臭、タバコ臭、ペット臭、生ごみ臭等の様々な悪臭の原因物質として知られる化合物や、悪臭防止法に基づいて指定される特定悪臭物質が含まれる（例えば、特許文献１、２）。カルボン酸を原因とするにおいを抑制できる技術はこれら悪臭課題の解決につながる。
【０００３】
カルボン酸を原因とするにおいに対する対策として、原因のにおい物質を吸着・分解してその存在量を減少させる消臭技術が提案されているが、におい物質減少までに時間を要するために即効性に欠ける。また、カルボン酸よりも強いにおいの香料によりマスキングする技術が提案されているが、このような技術は、カルボン酸を原因とするにおいを消臭するものではなく、カルボン酸を原因とするにおいを根本的になくすことはできない。また、芳香剤のにおいによる不快感が生じることもある。
【０００４】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。ヒトの場合、嗅覚受容体は約４００種存在することが報告されており、これらをコードする遺伝子はヒトの全遺伝子の約２％にあたる。一般的に、嗅覚受容体と匂い分子は複数対複数の組み合わせで対応付けられている。すなわち、個々の嗅覚受容体は構造の類似した複数の匂い分子を異なる親和性で受容し、一方で、個々の匂い分子は複数種の嗅覚受容体によって受容される。さらに、ある嗅覚受容体を活性化する匂い分子が、別の嗅覚受容体の活性化を阻害するアンタゴニストとして働くことも報告されている。これら複数種の嗅覚受容体の応答の組み合わせが、個々の匂いの認識をもたらしている。
【０００５】
従来、香料物質の開発においては、候補物質の匂いの評価は専門家による官能試験によって行われてきた。しかし、官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題があった。そこで近年では、候補物質に対する嗅覚受容体の応答を指標にした香料物質の探索方法が開発されている（特許文献３）。嗅覚受容体の応答は匂い物質に選択的であるため、最初に標的とする匂いに選択性を有する嗅覚受容体を見つけ出すことが肝要である。そうした嗅覚受容体を特定すれば、例えば悪臭の消臭を目的とする場合、アンタゴニストによる嗅覚受容体抑制又はアゴニストによる交差順応に基づくアプローチが可能となる。すなわち、悪臭であるカルボン酸を原因とするにおいをより効果的に抑制することが可能となる。実際これまでに、カルボン酸に応答する嗅覚受容体が複数特定されている。例えば、ヘキサン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｌ１が、ノナン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｅ１が、イソ吉草酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ５１Ｅ１が特定されている（特許文献１）。３－メチル－２－ヘキセン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｅ１及びＯＲ５１Ｉ２が、３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ１０Ａ６が特定されている（特許文献２）。吉草酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ５１Ｉ２が、ヘキサン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ５１Ｉ２、ＯＲ５１Ｌ１及びＯＲ５１Ｖ１が、４－メチル－３－ヘキセン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５１Ｌ１、ＯＲ５１Ｖ１が特定されている（特許文献４）。また、酪酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ５１Ｅ１が、３－メチル－２－ヘキセン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ５１Ｉ２及びＯＲ２Ｗ１が、３－ヒドロキシ－３－メチルヘキサン酸に応答する嗅覚受容体としてＯＲ２Ｗ１が特定されている（特許文献５）。しかし、既存の受容体解析方法では、全ヒト受容体の１２％程度しか機能解析に成功していない（非特許文献１）。このように、嗅覚システムは未だに解明されておらず、よって、分子生物学的アプローチにより特定の匂いに感受性がある嗅覚受容体を全て見出すことも容易でないという問題があった。
【０００６】
殆どの嗅覚受容体が解析に成功していない原因は、目的の嗅覚受容体ポリペプチドを培養細胞に作らせても、細胞の表面に移行（膜発現）せず、小胞体内に留まってしまうことにある。そのため、細胞外から投与するにおい物質に対する結合性を評価することができない。嗅覚受容体が膜発現しない原因については永らく未知であったが、近年、培養細胞で膜発現するマウス嗅覚受容体と膜発現しないマウス嗅覚受容体が比較解析された（非特許文献２）。その結果、膜発現しない嗅覚受容体は立体構造の安定性が低い可能性が見出された。そして重要なことに、膜発現可能な嗅覚受容体と不可能な嗅覚受容体との間にはタンパク質の一次アミノ酸配列において統計学上有意にＧｒａｎｔｈａｍｄｉｓｔａｎｃｅが異なるアミノ酸箇所が存在し、そのアミノ酸箇所とは、約一千種の全マウス嗅覚受容体において共通性の高いアミノ酸であることが示された。すなわち、膜発現しない嗅覚受容体とは、本来共通するアミノ酸が使われるべきポリペプチドの位置に、異なるアミノ酸への変異が起きたために、立体構造の安定性を欠き、培養細胞内で、細胞膜に移行させない判断が下されている可能性が示唆された。このことを踏まえると、嗅覚受容体間で共通性の高いアミノ酸を導入する「コンセンサス化法」によって、目的の嗅覚受容体を安定的なタンパク質として獲得することや、効率よく細胞膜上に発現させることが可能になると考えられる。
【０００７】
こうした考えのもと、非特許文献１では特定の嗅覚受容体を解析可能とするためにコンセンサス化法が用いられた。具体的には、ヒト嗅覚受容体ＯＲ６Ｙ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ５６Ａ４の３種類について、それぞれ１０種類の哺乳類（ゴリラ、ボノボ、チンパンジー、スマトラオランウータン、アカゲザル、ドリル、コモンマーモセット、ハイイロネズミキツネザル、ラット、マウス）の相同遺伝子間での共通性の高いアミノ酸を、それぞれのヒト嗅覚受容体に導入したコンセンサス嗅覚受容体ＯＲ６Ｙ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ５６Ａ４を作製した。その結果、３種の嗅覚受容体のうちＯＲ６Ｙ１は培養細胞を用いて匂い物質に対する応答測定を行うことが可能になったことが開示されている。したがって、コンセンサス化により応答解析が可能になる受容体は存在するものの、その割合は１／３程度であることが示唆されている。
【０００８】
コンセンサス化法は産業上有用な酵素を安定的なものにデザインするために古くから実施されてきた。しかし、本法に関する総説である非特許文献３によれば、ある一箇所のアミノ酸配列にコンセンサス化を導入して改善効果が得られる確率は５０％程度であり、残る４０％は逆にタンパク質を改悪してしまうリスクがあることが、コンセンサス化法の利用を難しくしていると指摘する。また、嗅覚受容体の本来の機能を推定することを目的とした研究においては、コンセンサス化方法の適用は適切ではないとする考え方がある。すなわち、アミノ酸置換を導入するアプローチには、オリジナル嗅覚受容体のリガンド結合部位を変化させ、その結果、本来のにおい応答性を観察させなくなる懸念がある。以上より、コンセンサス化には成功率の低さと、目的の嗅覚受容体本来の機能を変容させてしまうリスクの二つが予測されることから、幅広い嗅覚受容体に対する有効性が検証された例はなかった。
【０００９】
斯かる状況下、本発明者は、嗅覚受容体を培養細胞膜上に発現かつ機能させることができる手法について鋭意検討した結果、目的の嗅覚受容体のアミノ酸配列を、該目的の嗅覚受容体のアミノ酸配列と該目的の嗅覚受容体の特定のオルソログ又は特定のオルソログ及びパラログにコードされる嗅覚受容体のアミノ酸配列のアラインメントから従来とは異なる基準に従い導き出されるコンセンサスアミノ酸配列に基づいて改変することにより、改変された嗅覚受容体の培養細胞での膜発現をオリジナルの嗅覚受容体に比べて向上できること、改変された嗅覚受容体の匂い応答性をオリジナルの嗅覚受容体に比べて向上できること、また、改変された嗅覚受容体の培養細胞での膜発現がオリジナルの嗅覚受容体に比べて向上しない場合であっても改変された嗅覚受容体の匂い応答性を向上できること、さらに、改変された嗅覚受容体が改変前のオリジナルの嗅覚受容体のリガンド選択性をよく維持できること、改変された嗅覚受容体によりもたらされる解析結果はヒトの嗅覚をよく反映するものであることを見出した（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
特許第５６９７３８３号公報
特許第６４２２６６５号公報
特開２０１８－７４９４４号公報
特開２０２０－１０８３７０号公報
特表２０２１－５０４６７３号公報
特開２０２３－２４８４号公報
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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