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公開番号2024166338
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-28
出願番号2024160485,2021525090
出願日2024-09-17,2019-11-06
発明の名称乳、初乳及び酸性又は甘性ホエーから高度に精製されたラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼを製造する方法
出願人アルヘルプロジェクティランジェインインゼニリングディー.オー.オー.
代理人弁理士法人太陽国際特許事務所
主分類C07K 1/18 20060101AFI20241121BHJP(有機化学)
要約【課題】高純度な高活性ラクトフェリンの組成物を提供する。
【解決手段】ラクトフェリンタンパク質及び/又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分をこれらのタンパク質の少なくとも一つを含む原料から製造する方法であって、前記原料は、乳、初乳、酸性又は甘性ホエーからなる群から選択され、強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムを用いたクロマトグラフィー分離プロセスを利用し、前記分離プロセスにおいて、前記カラムに前記原料を導入後、pH勾配又はpH及び塩を組み合わせた勾配溶出を利用する、方法。さらに、C値が60%超であり、A値が1%超であるラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼを含む組成物が開示されている。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ラクトフェリンタンパク質及び／又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分をこれらのタンパク質の少なくとも一つを含む原料から製造する方法であって、
前記原料は、乳、初乳、酸性又は甘性ホエーからなる群から選択され、
強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムを用いたクロマトグラフィー分離プロセスを利用し、
前記分離プロセスにおいて、前記カラムに前記原料を導入後、ｐＨ勾配又はｐＨ及び塩を組み合わせた勾配溶出を利用する、方法。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記ｐＨ勾配が、約４．０～約８．０未満のｐＨ範囲内で開始する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐＨ勾配が、約８～１３未満のｐＨ範囲内で終了する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記原料が、カラムへの前記原料の導入前に、ろ過される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
約８～約１１未満のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍの範囲内のより高い伝導度において約６．６～約７．５のｐＨ範囲において溶出する画分Ａが回収される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍの範囲内のより高い伝導度において約９．６～約１０．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂが回収される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記クロマトグラフィー分離プロセスが、
（ｉ）前記原料のｐＨをｐＨ７未満の値、特にｐＨ６．５未満に調整する工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の原料を強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムと接触させる工程、次いで、
（ｉｉｉ）ｐＨ勾配緩衝剤を前記カラムに流し、それによって前記ｐＨ値を増加させる工程、及び
（ｉｖ）約８～約１１未満のｐＨ範囲、特に約８．０～約１０のｐＨ範囲、好ましくは約８．２～約１０のｐＨ範囲、より好ましくは約８．９～約１０のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍの範囲内のより高い伝導度において約６．６～約７．５のｐＨ範囲において溶出し、典型的にはラクトペルオキシダーゼを含む、画分Ａを回収する工程、及び／又は
（ｖ）約１０超～約１２．０のｐＨ範囲、好ましくは約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、より好ましくは１１．０超～１２．０のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍのより高い伝導度において約９．６～約１０．７のｐＨ範囲において溶出し、典型的にはラクトフェリンを含む、画分Ｂを回収する工程、
（ｖｉ）任意で、前記画分Ａ及び／又は前記画分Ｂを、特に、中和、濃縮及び保存などの処理によって、さらに処理する工程、
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記原料が、前記工程（ｉｉ）の前にろ過され、又は前記モノリスカラムが、前記工程（ｉｉ）の前に、約７未満、特に約６．５未満のｐＨ値を有する平衡化緩衝剤を用いて平衡化される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムが、－ＳＯ
３
Ｈ修飾モノリスカラム、－ＣＯＯＨ修飾モノリスカラム、－ＯＳＯ
３
Ｈ修飾モノリスカラム又は－ＯＰＯ
３
Ｈ修飾モノリスカラムからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩勾配が塩の濃度によって行われ、特に前記塩勾配は、約５ｍＳ／ｃｍ～約５５ｍＳ／ｃｍの範囲内における伝導度に対応する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質の少なくとも一つを含む原料からラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分を製造する方法並びに高度に精製されたラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質に関する。
続きを表示（約 2,800 文字）【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（ＬＦ）及びラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）は、乳、ホエー及び初乳中に存在する機能性の微量タンパク質である。ＬＦは、様々な生理的変化及び環境変化に対応可能な８０ｋＤａのグリコシル化タンパク質であり、そのために、ホストの防御の最前線において重要な成分だと考えられている。ＬＦの構造特性は、Ｆｅ
３＋
恒常性機能に加えて、全てのトランスフェリンに共通する機能である、広範囲の細菌、菌類、酵母、ウイルス及び寄生生物に対する広範なスペクトラムの抗菌活性；抗炎症活性及び抗発がん活性；並びにいくつかの酵素機能をもたらす［１］。ＬＰＯは、病原微生物に対する乳腺及び新生児の腸管の保護において極めて重要な役割を果たしており、様々な発がん物質の分解及び過酸化効果に対する動物細胞の保護に関与している［２］。
【０００３】
ＬＦは、鉄を結合させることができる。天然ＬＦは、１５～２０％のホロＬＦを含み、ホロＬＦは鉄を含む。残部はアポＬＦであり、アポＬＦは鉄を含まない［３２］。理論上では、アポＬＦはやや低い鉄飽和度を有する（既に結合した鉄－Ａ値）。アポＬＦのＡ値の理論値は、約３％未満である。さらに、アポＬＦは、高い鉄結合ポテンシャル（鉄容量－Ｃ値）を有する。アポＬＦのＣ値は、約５０％超である。高純度及び非変性のアポＬＦは、７０％超のより高いＣ値を有するポテンシャルを有している。一方で、ホロＬＦは高いＡ値（５０％超）及び低いＣ値（１０％未満）を有する。単離ＬＦのＣ値が高いほど、ＬＦの鉄結合ポテンシャルが高くなる。活性ＬＦは微生物の増殖に必要な鉄を除去するため、高い鉄結合ポテンシャルはより高レベルの抗菌活性をもたらす。
【０００４】
最近では、ＬＦ及びＬＰＯは、（Ｉ）ヘパリンリガンドを有するポリ(メタクリル酸グリシジル)を有する常磁性粒子による単離［３］、（ＩＩ）カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルジメチルアンモニウム）の使用［４］、（ＩＩＩ）様々なクロマトグラフィー法（例えば、カチオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー）［１、２、５～１０］、及び（ＩＶ）他の方法（例えば、疎水性イオン液体［１１］）などの多くの様々な方法によって、乳及び乳加工副生成物（例えば、ホエー）から単離される。一般的に、クロマトグラフィー法、特にイオン交換クロマトグラフィーは、ＬＦを比較的低コストで速く分離する方法を代表している［１２］。クロマトグラフィー法はまた、そのロバスト性及び繰り返し性のために他の方法に勝る。ＬＦ及びＬＰＯのクロマトグラフィー精製における最も一般的な方法では、強カチオン交換樹脂粒子及び膜又はモノリスカラムを用いる［１３～１５］。
【０００５】
現在のクロマトグラフィーは、（Ｉ）流速の増加に伴い、細孔内での拡散物質移動に起因してピークが広がるため、流速が増加する場合には、同じ分解能を得るために勾配の傾斜を緩やかにする必要があること、（ＩＩ）増加した流速は、クロマトグラフィー工程の時間を減少させるが、同時に溶出体積を増加させること、及び（ＩＩＩ）カラム長さによりカラムの圧力損失が大きくなり、流速の制限要因となることなどのいくつかの難点を有する。
【０００６】
クロマトグラフィー精製工程において、乳又はホエー中に存在するＬＦ及びＬＰＯは、所定の条件下で強カチオン交換体の表面に結合し、その後、高ｐＨ又は高塩濃度を有する緩衝剤を用いて溶出画分中に収集される。分離プロセスを簡略化するため、多くの場合、ＬＦ及びＬＰＯは、ステップモードにおいて高イオン強度又はｐＨ＞９のどちらかを有するいくつかの緩衝液を用いて溶出される。このような方法は、一つのクロマトグラフィー工程において、所望のタンパク質の画分について比較的高い純度（６０～９５％）をもたらすことが多い。脱塩、濃縮及び純度向上のため、限外ろ過法が微量の低分子量不純物を除去するために導入されることが多い。得られたタンパク質濃縮物は、その後、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥されることが多い。Ｗａｎｇ他は、凍結乾燥ＬＦが噴霧乾燥ＬＦ（≒５％）に比べてより少ない水（約２～３％）を含むが、それに対して噴霧乾燥ＬＦはわずかに低い変性度及び６～７％高い抗酸化活性を示し、新鮮な液体ＬＦに近いことを示した［１８］。噴霧乾燥［１］は、損傷のない分子構造及び高い抗酸化能力を有するアモルファスＬＦ粉末を製造するために確信を持って用いられている。
【０００７】
欧州特許第０４１８７０４号［１９］は、表面スルホン酸基を有する樹脂粒子を含むイオン交換クロマトグラフィーカラムを用いた、鉄と結合可能な乳タンパク質の分離、精製及び回収のプロセスを記載している。ＬＦは、ｐＨ／伝導度ステップ溶出モード（ｐＨ／ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｓｔｅｐｅｌｕｔｉｏｎｍｏｄｅ）によって単離され、最終生産物の純度は９０％超と主張されている。また、微量の低分子量不純物を除去するために限外ろ過法が必要とされ、最終的にＬＰＯ及びＬＦの純度は９０％以上とされている。
【０００８】
欧州特許出願公開第１４６６９２３号［２０］に記載されたプロセスは、強酸性カチオン交換樹脂（粒子）を用いたクロマトグラフィー工程を含み、単離ＬＦの純度が７９～９１％の範囲内にある。
【０００９】
国際公開第２００６／１１９６４４号［２１］は、ＬＦを精製し、溶液中で安定化させ、活性を向上させる方法を記載している。このプロセスは、既に単離された低純度のＬＦをさらに精製することを意図している。精製は、ある濃度の荷電した除外溶質を含む酸性水溶液の存在下で疎水性吸着剤（粒子）を用いて行われる。得られるＬＦの最終純度は、９５％超であった。
【００１０】
米国特許第５８６１４９１号［１３］は、組み換えヒトＬＦ（ｒｈＬＦ）をコードする導入遺伝子の発現によって生成されたヒトＬＦを含むヒトＬＦ及び他の関連ＬＦ種を、乳、典型的には牛乳から単離する方法を記載している。一般に、ｈＬＦを含む乳又は乳画分は、強カチオン交換樹脂への非ＬＦタンパク質及び他の物質の結合を抑制するために、比較的高いイオン強度において強カチオン交換樹脂と接触させられる。そして、樹脂粒子は遠心分離によって乳から分離され、所定のカチオン交換樹脂に結合したＬＦは、その後、ステップモードにおいて様々な塩濃度を有するいくつかの緩衝液を用いて溶出される。ｈＬＦ及びｂＬＦの上位画分（ｔｏｐｆｒａｃｔｉｏｎｓ）の純度は、約９５％超である。
（【００１１】以降は省略されています）

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