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公開番号2024166200
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-28
出願番号2024131763,2021531940
出願日2024-08-08,2019-11-26
発明の名称ゲノム編集による遺伝子サイレンシング
出願人シンジェンタクロッププロテクションアクチェンゲゼルシャフト
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20241121BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、ゲノム編集による遺伝子サイレンシングのための方法及び組成物を提供すること。
【解決手段】メガヌクレアーゼ(MN)、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、Cas9ヌクレアーゼ、Cfp1ヌクレアーゼ、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、キメラCas9/Cpf1-シチジンデアミナーゼ、キメラCas9/Cpf1-アデニンデアミナーゼ、キメラFEN1-FokI、及びMega-TAL、ニッカーゼCas9(nCas9)、キメラdCas9非FokIヌクレアーゼ、及びdCpf1非FokIヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを提供した。加えて、本発明は、ゲノム編集による遺伝子サイレンシングのための方法及び組成物を提供し、ゲノム編集によって染色体を再配置するための方法及び組成物も提供される。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
ａ）標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと；
ｂ）単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと；
ｃ）前記二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと；
ｄ）前記標的遺伝子の発現を減少させることと：
からなる、前記標的遺伝子の発現を減少させる方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子における前記二本鎖切断が、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞が、一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体ゲノムを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子が劣性又は半優性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上のガイド配列を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のガイド配列が、２つ以上のガイド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ゲノム編集によって染色体を再配置する方法であって：
ａ．部位特異的ヌクレアーゼによって前記染色体に少なくとも１つの破損を生成することと；
ｂ．再配置を有する染色体を選択することと、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１２月４日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１９１５５号による利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,300 文字）【０００２】
配列表
２０１８年１１月１９日に生成された、「８１７２４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題される、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下で提出された、４７キロバイトのサイズのＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表。この配列表は、その開示について参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、ゲノム編集による遺伝子サイレンシング、又はゲノム編集による染色体の再配置のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子サイレンシングは、遺伝子機能を研究し、作物に重要な形質を送達するための重要なツールである。植物における遺伝子サイレンシングの伝統的戦略には、（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｌ．２００６；７１：４８１－５）、センスＲＮＡ転写産物のトランスジェニック過剰発現、ヘアピン転写産物のトランスジェニック発現、アンチセンスＲＮＡ転写産物のトランスジェニック発現が含まれる。一方、これらの技術には、いくつかの制約がある。過剰産生されたセンス転写産物については、転写産物は未熟な終止コドンを有さない必要があり、そうでない場合、効率は十分ではなく、安定ではない。ヘアピン及びアンチセンス設計では、同じ組織及び同じ発達段階でのサイレンシングＲＮＡの発現を天然の標的ｍＲＮＡと一致させることが不可能であるため、ＲＮＡサイレンシング効果には漏れがある。
【０００５】
本開示は、染色体逆位を作り出すためのゲノム編集を用いた新規な遺伝子サイレンシング方法を提供する。ゲノム編集は、例えば国際公開第１８０５７８６３号、国際公開第２０１７１８０９１５号、及び国際公開第２０１７０２３９７４号のように、サイレンシングされるべき遺伝子のプロモーターに転写調節因子を近づけることを除いて、遺伝子サイレンシングでは用いられてこなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、標的遺伝子の発現を減少させる方法を提供し、該方法は、標的ゲノム部位での部位特異的ＤＮＡ切断が可能なヌクレアーゼを細胞内に導入することと、単一の標的遺伝子において２つ以上の二本鎖切断を作ることと、二本鎖切断が介在ＤＮＡ逆位で修復された細胞を選択することと、標的遺伝子の発現を減少させることとからなる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、標的遺伝子における二本鎖切断は、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン、イントロン、又は遺伝子－遺伝子接合領域に位置する。これらの方法は、細胞が一倍体、二倍体、倍数体、又は六倍体（hexiploid）のゲノムを有する場合に用いられ得る。これらの方法は、標的遺伝子が優性、劣性、又は半優性の場合に用いられ得る。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ、２つ又はそれを超えるガイド配列を利用することができる。この方法は、植物細胞において有用であるが、任意の細胞に適用可能である。
【０００７】
本開示は、ゲノム編集によって染色体を再配置する方法を提供し、該方法は、部位特異的ヌクレアーゼによって染色体に少なくとも１つの破損を生成することと、再配置を有する染色体を選択することとを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｆｐ１ヌクレアーゼ、ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩ、ｄＣｐｆ１－ＦｏｋＩ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－シチジンデアミナーゼ、キメラＣａｓ９／Ｃｐｆ１－アデニンデアミナーゼ、キメラＦＥＮ１－ＦｏｋＩ、及びＭｅｇａ－ＴＡＬ、ニッカーゼＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、キメラｄＣａｓ９非ＦｏｋＩヌクレアーゼ、及びｄＣｐｆ１非ＦｏｋＩヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼを利用することができる。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、欠失、重複、逆位、又は転座を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、遺伝子発現の改変を引き起こす。本方法のいくつかの実施形態では、遺伝子発現の改変は、前駆体ｍＲＮＡレベル、又は成熟ｍＲＮＡレベル、又は翻訳レベルでの調節を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、染色体が種間雑種のような１つの核に分類され得る場合に、２つの種由来の染色体を含む。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、少なくとも２つの対立遺伝子又は異なる対立遺伝子由来の２つの成分を融合することによって、新たな対立遺伝子生成をもたらす。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、プロモーター、エキソン、イントロン、又は転写ターミネーターを標的とする。本方法のいくつかの実施形態では、染色体再配置は、再配置された遺伝子と配列類似性を有する異なる遺伝子の遺伝子発現の改変を引き起こす。本方法の更なる実施形態では、欠失、重複、逆位、又は転座は、１９塩基対以上である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
構築物２２６０２（左）を用いた形質転換事象のグラフ表示であり、ここで、エキソン５における２つの編集は、事象ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ１３０Ａにおける欠失又は事象ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ０４９Ａにおける逆位をもたらし、また構築物２２６０４（右）を用いた形質転換事象の表示であり、ここで、エキソン５における２つの編集は、事象ＲＩＥＴ１４２３００Ａ０１４Ａにおける欠失又は事象ＲＩＥＴ１４２５００Ｂ０２４Ａ０４９Ａにおける逆位をもたらした。
内因性遺伝子座からのＤＥＰ１の発現を測定するためのワークフローを示す。
事象ＲＩＥＴ１４２２０２Ａ１３０ＡからのＴ１種子の遺伝子型判定からのＰＣＲ産物のゲル電気泳動。
ＤＥＰ１に欠失を有する植物の隣の野生型イネ植物。
ＲＮＡ単離のためにサンプリングされた２～３ｃｍのイネ植物。
ＦＩ植物１７ＳＢＣ５００１４０、１７ＳＢＣ５００１４３、１７ＳＢＣ５００１４６、及び１７ＳＢＣ５００１４９からのｒｔＰＣＲ産物のゲル電気泳動。
欠失又は挿入を有するＦ１植物におけるＤＥＰ１のエキソン５のグラフ表示（上）及びゲル電気泳動によって分離されたｒｔＰＣＲ産物（下）であり、ＤＥＰ１産物は、定量され、イネユビキチン遺伝子ＯＳ０３ｇ０２３４２００の発現比に対して正規化された。
２つの転座で同定されたＥ０植物、ＲＩＥＴ１４２５００Ａ０８４ＡからのＤＥＰ１のエキソン５のグラフ表示。
染色体転座及び重複について選択するために、２つ以上のゲノム編集標的がどのように使用され得るかを示す概略図。
逆位がどのように遺伝子サイレンシングに導くことができるかを示す概略図。
六倍体又は倍数体ゲノムの遺伝子オルソログをサイレンシングするために、染色体逆位によるサイレンシングがどのように使用され得るかを示す概略図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列表における配列の簡単な説明
配列番号１は、ＤＥＮＳＥＡＮＤＥＲＥＣＴＰＡＮＩＣＬＥ１のコード配列である
【００１０】
配列番号２は、ベクター２２６０３由来のｇＲＮＡ－Ｂ及びｇＲＮＡ－Ｄ発現カセットである
（【００１１】以降は省略されています）

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