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公開番号2024127458
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-20
出願番号2023036623
出願日2023-03-09
発明の名称キメラタンパク質
出願人国立大学法人山梨大学
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/55 20060101AFI20240912BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】PLCの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子を提供すること。
【解決手段】ホスホリパーゼCのTIMドメイン、SspBドメイン、及びホスホリパーゼCのbarrelドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質。
続きを表示（約 540 文字）【請求項２】
ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを、この順で有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
ホスホリパーゼＣのＸ－Ｙリンカー配列を有さない、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸を含むことを特徴とする細胞。
【請求項７】
ＳｓｒＡをコードする塩基配列を含む核酸を含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項６に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラタンパク質及びその製造方法、核酸、ベクター、細胞、ホスホリパーゼＣの制御方法、ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法、並びに化合物のスクリーニング方法に関する。
続きを表示（約 2,900 文字）【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、生体のシグナル伝達経路において重要な役割を果たし、細胞内で様々な反応に関与することが知られている。
内在性ＰＬＣは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、成長因子受容体（ＲＴＫ）、及び低分子量Ｇタンパク質の一種であるＲａｃとＲｈｏなどにより活性化されることが知られているが、ＰＬＣの自発的な活性化機構は未だ知られていない。
【０００３】
近年光遺伝学の発展により光駆動型システムが開発されている。光駆動型システムを使用することにより、タンパク質の活性化を光を用いて制御することが可能である。前記光駆動型システムとして、非特許文献１には、エンバクのＬＯＶ２ドメインにＳｓｒＡペプチドを埋め込んだ、改良光誘導性二量体（ｉＬＩＤ）が記載されている。前記ｉＬＩＤは、青色光で活性化されると、ＬＯＶ２ドメインのＣ末端ヘリックスがタンパク質から切り離され、ＳｓｒＡペプチドがＳｓｐＢに結合できるようになる。
ＰＬＣを活性化する光駆動型システムとしては、Ｏｐｔｏ－α１ＡＲ、Ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ、Ｍａｇｎｅｔ－Ｇｑ、Ｏｐｔｏ－ＲＴＫ、ＰＡ－Ｒａｃ、ＰＡ－Ｒｈｏなどが報告されている（非特許文献２～４など）。しかしながら、これらのＰＬＣを活性化する光駆動型システムは、ＰＬＣのシグナル伝達の上流に位置するタンパク質を標的としており、ＰＬＣの特異性は低かった。
【０００４】
したがって、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
ＰＮＡＳ２０１５１１２：１１２－１１７
Ｎａｔｕｒｅ２００９４５８：１０２５－１０２９
ＰｒｏｃＲＳｏｃＢ２０１３２８０：２０１２２９８７
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ２０１６６：３５７７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有するキメラタンパク質、前記キメラタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター及び細胞、並びに、前記細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法により、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子が提供でき、これらを用いたホスホリパーゼＣの制御方法、ホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法、及び化合物のスクリーニング方法が提供できることを知見した。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下のとおりである。即ち、
＜１＞ホスホリパーゼＣのＴＩＭドメイン、ＳｓｐＢドメイン、及びホスホリパーゼＣのｂａｒｒｅｌドメインを有することを特徴とする、キメラタンパク質である。
＜２＞前記＜１＞に記載のキメラタンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸である。
＜３＞前記＜２＞に記載の核酸を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞前記＜２＞記載の核酸を含むことを特徴とする細胞である。
＜５＞前記＜４＞に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とするキメラタンパク質の製造方法である。
＜６＞前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣの制御方法である。
＜７＞前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含むホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達の解析方法である。
＜８＞前記＜４＞に記載の細胞に青色光を照射することを含む化合物のスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＰＬＣの活性化を特異的に制御できる光駆動型システムを構築するための分子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１Ａは、マウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造を示す図である。
図１Ｂは、ＳｓｐＢドメインを付加したマウスＰＬＣβ３の活性中心の立体構造の予測図である。
図２は、ＰＬＣタンパク質の構造と光駆動型ＰＬＣタンパク質のデザインを示す模式図である。
図３Ａは、ＰＬＣを介したシグナル伝達経路の一例を示した模式図である。
図３Ｂは、試験例１のウェスタンブロットの結果を示す図である。
図３Ｃは、試験例１のリン酸化ＰＫＤ１についてのバンド強度を示す図である。
図３Ｄは、試験例１のリン酸化ＥＲＫについてのバンド強度を示す図である。
図４Ａは、ＰＬＣタンパク質の構造と光駆動型ＰＬＣタンパク質のデザインを示す模式図である。
図４Ｂは、試験例２のウェスタンブロットの結果を示す図である。
図４Ｃは、試験例２のリン酸化ＰＫＤ１についてのバンド強度を示す図である。
図４Ｄは、試験例２のリン酸化ＥＲＫについてのバンド強度を示す図である。
図５Ａは、試験例３の照射前の蛍光輝度を示した写真である。
図５Ｂは、試験例３の照射後の蛍光輝度を示した写真である。
図５Ｃは、試験例３の蛍光輝度の経時変化をプロットした図である。
図６Ａは、ＰＬＣによる脂質組成の変動の一例を示した模式図である。
図６Ｂは、試験例４－１の照射前の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｃは、試験例４－１の照射後の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｄは、試験例４－２の照射前の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｅは、試験例４－２の照射後の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｆは、試験例４－３の照射前の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｇは、試験例４－３の照射後の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｈは、試験例４－４の照射前の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｉは、試験例４－４の照射後の蛍光輝度を示した写真である。
図６Ｊは、試験例４の細胞質側の蛍光輝度の経時変化をプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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