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公開番号2024156675
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024109107,2022513402
出願日2024-07-05,2019-08-28
発明の名称非定型スプリットインテインおよびそれらの使用
出願人ザ・トラスティーズ・オブ・プリンストン・ユニバーシティ,THE TRUSTEES OF PRINCETON UNIVERSITY,アルバートアインシュタインカレッジオブメディシン
代理人個人,個人,個人
主分類C07K 14/00 20060101AFI20241029BHJP(有機化学)
要約【課題】様々なタンパク質精製およびタンパク質修飾用途における使用のための、よりロバストでより効率的なスプリットインテインを提供する。
【解決手段】本開示は非定型スプリットN末端およびC末端インテインおよびそれらの変異体に関する。本開示はまた、本開示のスプリットN末端またはC末端インテインを含んでなる複合体および目的化合物およびその複合体を含んでなる組成物にも関する。さらに、本開示は、非定型スプリットN末端およびC末端インテインを使用する方法にも関する。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含んでなる、スプリットインテインＮ末端断片。
続きを表示（約 980 文字）【請求項２】
前記変異体が配列番号２～６、１２５～１２７および１６８～１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のスプリットインテインＮ末端断片。
【請求項３】
前記変異体が配列番号１の機能的に同等の変異体である、請求項２に記載のスプリットインテインＮ末端断片。
【請求項４】
前記機能的に同等の変異体が配列番号４または配列番号１２５のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載のスプリットインテインＮ末端断片。
【請求項５】
（ｉ）目的化合物、
（ｉｉ）請求項１～４のいずれか一項に記載のスプリットインテインＮ末端断片、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体であって、
前記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
前記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
前記複合体がリンカーを含んでなる場合には、前記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または前記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている、複合体。
【請求項６】
前記スプリットインテインＮ末端断片が、配列番号４９～６８からなる群から選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含んでなる、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記目的化合物がポリペプチドまたはタンパク質であり、複合体がリンカーを含んでなる場合には、リンカーはペプチドリンカーである、請求項５または６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記目的ポリペプチドが抗体またはタンパク質の断片である、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
前記目的化合物がタンパク質のＮ末端断片である、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１～５のいずれか一項に記載のスプリットインテインＮ末端断片または請求項７に記載の複合体をコードするポリヌクレオチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
発明における政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成番号ＧＭ０８６８６８、ＯＤ０１６３０５、ＲＲ０１５４９５およびＯＤ０１６４３２の下、政府の支援で行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
続きを表示（約 2,000 文字）【０００２】
発明の分野
本開示は、バイオテクノロジーの分野に含まれ、具体的には、スプリットインテインおよびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インテインは、宿主タンパク質からそれ自体を切り出すと同時に、痕跡無くその隣接ポリペプチド配列（エクステイン）を連結して天然型のペプチド結合を形成するタンパク質スプライシングと呼ばれる翻訳後オートプロセシングイベントを受ける介在タンパク質ドメインである。ほとんどのインテインは、単一の遺伝子内に埋め込まれた連続的ドメインとして見られ、シスでスプライスする。しかしながら、一部はスプリット形態で天然に存在し、それにより、各インテイン断片は別々に発現される遺伝子にコードされ、トランスでのスプライシングの前にまず会合しなければならない。これらのスプリットインテインはタンパク質工学のツールとして一般に適用され、それらの特異性の高い認識および独特な活性のために、細胞環境において特に使用しやすい。
【０００４】
化学生物学においてインテインがますます使用されているにもかかわらず、それらの実用的有用性は、いくつかの一般的特徴、すなわち（ｉ）速度が遅い、（ｉｉ）直接隣接するエクステイン配列に関してコンテキスト依存性の効率、（ｉｉｉ）他のタンパク質との組換え融合の発現レベルが低い、および（ｉｖ）安定性が最適に至っていないことによって制約を受けてきた。
【０００５】
よって、様々なタンパク質精製およびタンパク質修飾用途における使用のための、よりロバストでより効率的なスプリットインテインの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本開示の著者らは、これにより、本願の実施例１（図５、表５および６）に示されるように、悪条件下でも加速化されたスプライシング速度および活性を示す、非定型スプリット部位を有するスプリットインテインを提供する。開示されるインテインは、発現されるタンパク質のＮ末端修飾に有用であり、発現したタンパク質の連結、トランスペプチダーゼに基づく連結戦略、および様々なタンパク質化学法など、タンパク質のＮ末端修飾に関して報告されている他の方法を補う。これに関して、これらのインテインのＮ末端インテイン断片は著しく短いことから、目的のスプリットインテインＮ末端断片の複合タンパク質が固相ペプチド合成を用いて容易に得ることができるので、単離されるポリペプチドは、ある範囲のタンパク質修飾において使用するのに理想的に適している。
【０００７】
よって、本開示の１つの側面において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片に関する。
【０００８】
本開示の別の側面は、
（ｉ）目的化合物、
（ｉｉ）本開示のスプリットインテインＮ末端断片、または配列番号１０３～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるスプリットインテインＮ末端断片
を含んでなる複合体であって、
上記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に連結されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＮ末端断片のＮ末端に結合されている複合体に関する。
【０００９】
本開示の別の側面は、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と少なくとも８８％の配列同一性を有するその変異体を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片に関する。
【００１０】
本開示の別の側面は、
（ｉ）本開示のスプリットインテインＣ末端断片または配列番号１１４～１２０からなる群から選択される配列を含んでなるスプリットインテインＣ末端断片、および
（ｉｉ）目的化合物
を含んでなる複合体であって、
上記複合体は、場合により（ｉ）と（ｉｉ）の間にリンカーを含んでなり、
上記目的化合物は、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されているか、または
上記複合体がリンカーを含んでなる場合には、上記目的化合物はアミド結合によってリンカーに結合され、かつ／または上記リンカーは、アミド結合によってスプリットインテインＣ末端断片のＣ末端に結合されている複合体に関する。
（【００１１】以降は省略されています）

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