特許ウォッチ

公開番号2024123021
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-10
出願番号2024088815,2021524387
出願日2024-05-31,2019-11-09
発明の名称モグロシドの生合成
出願人ギンゴーバイオワークス, インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/61 20060101AFI20240903BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】組み換え細胞におけるモグロール前駆体、モグロールおよび/またはモグロシドを産生する方法を提供する。
【解決手段】特定の配列を有する酵素(例えば、ククルビタジエノールシンターゼ(CDS)、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ(UGT)、C11ヒドロキシラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ(EPH)、スクアレンエポキシダーゼおよび/またはシトクロムP450レダクターゼ)、該酵素を発現する宿主細胞およびこのような宿主細胞を使用してモグロール前駆体、モグロールおよび/またはモグロシドを産生する方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該ＣＤＳが
ａ)モチーフＧＸ
１
ＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３１)(ここで、Ｘ
１
はＮまたはＨである)；
ｂ)モチーフＤＸ
１
ＧＷＬ(配列番号３３２)(ここで、Ｘ
１
はＨまたはＱである)；および／または
ｃ)モチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)
を含み、ここで、該ＣＤＳは、ラカンカＣＤＳ(配列番号７３)の配列を含まず；そしてここで、該宿主細胞は、対照に比して少なくとも１０％、２０％または３０％多いククルビタジエノール化合物を産生し、ここで、該対照は、配列番号３３に対応するポリヌクレオチドによりコードされるラカンカＣＤＳを発現する宿主細胞である、宿主細胞。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
ａ)モチーフＧＸ
１
ＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３１)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基１１７～１２６に対応する残基に存在し；
ｂ)モチーフＤＸ
１
ＧＷＬ(配列番号３３２)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基４７９～４８３に対応する残基に存在し；および／または
ｃ)モチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基６１２～６２２に対応する残基に存在する、
請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該ＣＤＳが
ａ)モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)；および／または
ｂ)モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)を含む、
宿主細胞。
【請求項４】
ａ)モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基１１７～１２６に対応する残基に存在し；および／または
ｂ)モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基４７９～４８３に対応する残基に存在する、
請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該ＣＤＳが
ａ)モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)；
ｂ)モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)；および／または
ｃ)モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)を含む、
宿主細胞。
【請求項６】
ａ)モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基１１７～１２６に対応する残基に存在し；
ｂ)モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)がＣＤＳにおいて配列番号７３において残基４７９～４８３に対応する残基に存在し；および／または
ｃ)モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)がＣＤＳにおいて配列番号７３における残基６１２～６２２に対応する残基に存在する、
請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
異種ポリヌクレオチドが配列番号３、９または１２と少なくとも９０％同一である、請求項１～６の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項８】
該ＣＤＳが配列番号４３、４９または５２と少なくとも９０％同一である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
異種ポリヌクレオチドが配列番号３と少なくとも９０％同一である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
該ＣＤＳが配列番号４３と少なくとも９０％同一である、請求項８に記載の宿主細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月９日出願の「Biosynthesis of Mogrosides」なる名称の米国仮出願６２／７５８,４７４に基づく35 U.S.C. § 119(e)下の優先権の利益を主張し、その開示を、全体として引用により本明細書に包含させる。
続きを表示（約 3,400 文字）【０００２】
ＥＦＳ－ＷＥＢによりテキストファイルとして提出した配列表の記載
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してASCII形式で提供した配列表を含み、ここにその全体を引用により包含させる。該ASCIIコピーは２０１９年１１月９日に作成し、G091970023WO00-SEQ-OMJ.TXTなる名称であり、９２８キロバイトサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、組み換え細胞におけるモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドの産生に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
モグロシドは、ククルビタン誘導体の配糖体である。甘味料および糖代替物として高度に需要がある、モグロシドは、シライチア・グロスベノリイ(Siraitia grosvenorii)(ラカンカ)を含む食物果実で天然に合成されている。抗癌、抗酸化および抗炎症性質はモグロシドに帰属するとされているが、モグロシド生合成に関与する正確な酵素の特徴づけは限られている。さらに、果実からのモグロシド抽出は大きな労働力を要し、モグロシドの構造の複雑さが、デノボ化学合成をしばしば妨げている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明の態様は、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域；および／または野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域を含み；ここで、該宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
【０００６】
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応する構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＨ８３；Ｔ８４；Ｔ８５；Ｎ８６；Ｐ８９；Ｌ９２；Ｙ１７９；Ｓ１８０；Ａ１８１；Ｇ１８４；Ａ１８５；Ｖ１８６；Ｔ１８７；Ｋ１８９；Ｈ１９１；Ｋ１９２；Ｇ１９４；Ｅ１９５；およびＡ１９８から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域；および／または野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域を含み；ここで、該ＵＧＴは、配列番号１０９に９０％未満の同一性を含む。
【０００８】
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応する構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
【０００９】
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のＮ１４３またはＬ３７４に対応する残基の位置にアミノ酸置換を含み、ここで、該宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体存在下、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
【００１０】
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して、活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応するＵＧＴの構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許