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公開番号2024120588
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-05
出願番号2023027471
出願日2023-02-24
発明の名称エンテロバクター属菌の遺伝子型タイピング法およびこれに用いるプライマーセット
出願人関東化学株式会社,学校法人藤田学園
代理人個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20240829BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】実際の産業(医療現場)利用に適したECCの菌株識別法を提供すること、およびそれに用いるプライマーセットを提供すること。
【解決手段】供試菌の菌種同定および/または菌株識別のための方法であって、
供試菌の染色体上の、
(1)Enterobacter hormaechei特異的オープンリーディングフレーム(ORF)、
(2)Enterobacter asburiae特異的ORF、
(3)Enterobacter sp. close to E. asburiae特異的ORF
(4)E. hormaechei染色体上のST型推定に有用なゲノムアイランドを構成するORFおよびST型推定に有用なゲノムアイレットを構成するORF、
(5)E. asburiaeの染色体上のST型推定に有用なゲノムアイランドを構成するORF、
(6)E. hormaechei染色体上の菌株識別に有用なゲノムアイランドを構成するORFおよび菌株識別に有用なゲノムアイレットを構成するORF
のいずれか1つ以上の有無を検出し、ORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、前記方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
供試菌の菌種同定および／または菌株識別のための方法であって、
供試菌の染色体上の、
（１）Enterobacter hormaechei特異的オープンリーディングフレーム（ORF）、
（２）Enterobacter asburiae特異的ORF、
（３）Enterobacter sp. close to E. asburiae特異的ORF
（４）E. hormaechei染色体上のST型推定に有用なゲノムアイランドを構成するORFおよびST型推定に有用なゲノムアイレットを構成するORF、
（５）E. asburiaeの染色体上のST型推定に有用なゲノムアイランドを構成するORF、
（６）E. hormaechei染色体上の菌株識別に有用なゲノムアイランドを構成するORFおよび菌株識別に有用なゲノムアイレットを構成するORF
のいずれか１つ以上の有無を検出し、ORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、前記方法。
続きを表示（約 2,200 文字）【請求項２】
（１）、（４）および／または（６）のORFの有無を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）、（２）および（３）のORFの有無を検出する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（２）および（５）のORFの有無を検出する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（１）のORFがLI66_04605（配列番号１０６）であり、（２）のORFがNF29_17240（配列番号１０７）であり、（３）のORFがECNIH4_02210（配列番号１０８）であり、（４）のE. hormaechei染色体上のゲノムアイランドを構成するORFがAM432_16960（配列番号１０９）、AM432_02885（配列番号１１０）、AM432_06075（配列番号１１２）、AM432_12345（配列番号１１５）、AM451_02655（配列番号１１６）、およびAM432_08555（配列番号１１８）の６種であり、ゲノムアイレットを構成するORFがAM432_17020（配列番号１１４）の１種であり、（５）のE. asburiae染色体上のゲノムアイランドを構成するORFがACJ69_15600（配列番号１１１）、NF29_16315（配列番号１１３）、およびAB190_16475（配列番号１１７）の3種であり、ならびに／または、（６）E. hormaechei ST78株の染色体上のゲノムアイランドを構成するORFがLI64_04005（配列番号１１９）、LI66_19120（配列番号１２３）、AM409_17200（配列番号１２４）、LI63_021875（配列番号１２５）、LI63_018475（配列番号１２７）、AM383_04310（配列番号１２８）、LI62_04085（配列番号１２９）、LI62_09620（配列番号１２０）、およびLI66_10685（配列番号１２１）の９種であり、ゲノムアイレットを構成するORFがLI66_08680（配列番号１２２）およびLI66_19065（配列番号１２６）の２種である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号３と４に示された塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなるプライマーを用いて、PCR法により（１）のORFの検出を行い、配列番号５と６に示された塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなるプライマーを用いて、PCR法により（２）のORFの検出を行い、
配列番号７と８に示された塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなるプライマーを用いて、PCR法により（３）のORFの検出を行い、
配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１５と１６、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２７と２８に示された７組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなる７組のプライマーを用いて、PCR法により（４）のORFの検出を行い、
配列番号１３と１４、配列番号１７と１８、配列番号２５と２６に示された３組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなる３組のプライマーを用いて、PCR法により（５）のORFの検出を行い、ならびに／または、
配列番号３１と３２、配列番号３３と３４、配列番号３５と３６、配列番号３７と３８、配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号４３と４４、配列番号４５と４６、配列番号４７と４８、配列番号４９と５０、配列番号５１と５２に示された１１組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなる１１組のプライマーを用いて、PCR法により（６）のORFの検出を行う、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（７）カルバペネム分解酵素であるblaIMP-1 groupの遺伝子
の有無をさらに検出することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号２９と３０に示された塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していてもよい）からなるプライマーを用いて、PCR法により（７）の遺伝子の検出を行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失および／または挿入を有していない、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロバクター（Enterobacter）属菌、とくにEnterobacter cloacae complex（以下、ECCともいう。）の菌種同定法および菌株識別法に関する。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
ECCは環境中に広く分布しており、またヒト腸内の常在菌である。通常、ヒトに対する病原性は低いが、免疫が低下した患者に対しては日和見感染症の起因菌になる。ECCはEnterobacter cloacae(以下、E. cloacaeという。)と遺伝学的に近縁な菌種の総称であり、代表的な菌種はE. cloacae, Enterobacter hormaechei(以下、E. hormaecheiという。)、Enterobacter asburiae(以下、E. asburiaeという。)、Enterobacter kobei(以下、E. kobeiという。)、Enterobacter ludwigii(以下、E. ludwigiiという。)の5種類である。
【０００３】
近年、感染症治療の最後の砦と言われているカルバペネム系抗菌薬を含むほぼ全てのβ-ラクタム系抗菌薬に耐性を示すECCが報告されている。カルバペネム系抗菌薬に耐性を示すECCの中でも、カルバペネム分解酵素であるカルバペネマーゼを産生するECCはβ-ラクタム系抗菌薬以外の抗菌薬にも耐性を示す場合が多く、このようなECCを起因菌とする感染症は治療が困難となる。また、カルバペネム分解酵素の遺伝子はプラスミドDNAにコードされているため、菌種を超えて薬剤耐性能を伝播させることが知られている。本邦のカルバペネム系抗菌薬に対するE. cloacaeの耐性率は2020年時点で約1%と低い水準にあり、今後もこの状態を維持する必要がある。
【０００４】
以上のことから、医療機関においてこれらの菌の感染制御や院内感染対策を行うため、原因菌を早期に検出することが重要となっている。
院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌や共用の医療機器、施設などの環境中から分離された菌の菌株が同一か否か、ならびにカルバペネム系抗菌薬に対する耐性遺伝子を持つか否かを判定する必要がある。
【０００５】
菌種の同定法としては、菌に由来したタンパク質成分の分子量情報のパターンから菌種を判定する質量分析法が知られている。菌体または菌体から得られた試料をイオン化し、イオンを質量ごとに分離、質量分析から得たマススペクトルのピークパターンを既存のデータベースと照合することで菌種を同定する方法で、迅速に結果を得られることから近年広く使用されている。
【０００６】
菌株の識別は、菌株が保有するゲノムの特徴を検出することで行うことが多く、multilocus sequence typing（以下、MLSTという。）法やパルスフィールドゲル電気泳動（以下、PFGEという。）法が用いられる。
MLSTは、７種類のハウスキーピング遺伝子の塩基配列の変異を数値化したSequence Type（以下、STという。）で菌株識別を行う方法である。しかし、7種類の遺伝子の塩基配列を決定する必要があるためコストが高くなる。また、ST型が同一となる近縁なクローンの菌株識別は行えない。
PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性がある。しかし、結果が出るまでに早くても菌株分離同定後3～4日程度と時間がかかり、作業が煩雑で作業者の熟練を要する。
【０００７】
他方、エンテロバクター属菌以外の各種の細菌の遺伝型分類法に関する報告がなされており、例えば、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献２には、緑膿菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献３には、アシネトバクター属菌の遺伝子型別法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献４には、大腸菌の遺伝子型別法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献５にはClostridium difficileの遺伝子型別法およびこれに用いるプライマーセットが、特許文献６には肺炎桿菌および近縁菌種の遺伝子型別法およびこれに用いるプライマーセットが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特開２０１１－１２０５２８号公報
特開２０１３－１４６２４４号公報
特開２０１４－２０７８９５号公報
特開２０１６－４９１０９号公報
特開２０１９－４８１１号公報
特開２０２０－１１５７９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ECCはヒト腸内の常在菌であるが、免疫が低下した患者に対しては日和見感染症の起因菌となる。また、感染症治療の最後の砦と言われているカルバペネム系抗菌薬を含むほぼ全てのβ-ラクタム系抗菌薬に耐性を示すECCも見出され、医療現場における感染制御が課題となっている。そこで、薬剤耐性菌対策や効果的な感染制御を実施する上では感染源や感染ルートを特定することが重要であり、そのために、分離菌株の分子疫学解析が必要となる。院内感染が疑われる事例では、菌種の同定のため、質量分析法が用いられることが多い。しかし、質量分析法では、ECCに含まれる菌種の多くは詳細な菌種の判定がなされないままECCと判定されているかまたはE. cloacaeと判定されているに過ぎず、遺伝学的に極めて近縁な関係にある菌種同士を正確に同定することができないといえる。
本発明の開発工程の中で、菌株の全ゲノム配列を用いた菌種同定法であるAverage Nucleotide Identity(以下、ANIという。)法を用いてECCの菌種同定を行った結果、ECCの多くはE. hormaecheiであることが明らかとなった。例えば、National Center for Biotechnology Information: 米国生物工学情報センター（以下、NCBIという。）が提供する公共データベースであるGeneBank上に、2018年5月7日時点でE. cloacaeとして登録されていた菌株618株のうち、E. cloacaeは57株のみであり、413株はE. hormaecheiであることが本発明者らによって今般判明した。したがって、これらの本願発明者らが実施したANI法に基づく菌種同定の結果から、GeneBank上でE. cloacaeと同定されている菌株の多くは、現時点においてはE. hormaecheiであることが初めて示唆された。
つまり、ECC株の多くはE. hormaecheiであるが、質量分析法でECCに含まれる菌種の多くは詳細な菌種の判定がなされないままECCと判定されているかまたはE. cloacaeと判定されるため、E. hormaecheiであるか否かの判定はできない。また、ECCには、種名登録はないがE. asburiaeに近縁な新たな種があることを本発明者らは疑っていたが、これについてもこれまでは明らかになっていなかった。
菌株の識別ではパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法が用いられることが多いが、PFGE法は作業が煩雑で作業者の熟練を要する。また、菌株の識別と同時に、カルバペネム系抗菌薬に対する耐性遺伝子の有無についても判定が必要となる場合、従来、菌種の同定、菌株の識別、および耐性遺伝子の検出は個々の方法により行っており、手間が多く、多大な労力を要していた。
【００１０】
本発明は、上記実情に鑑みて、簡便、迅速、客観的、かつ高感度にECCの菌種同定および／または菌株識別を可能にする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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