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公開番号2024083479
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-06-21
出願番号2024061564,2021102533
出願日2024-04-05,2016-02-09
発明の名称エピゲノム編集のための組成物および方法
出願人デュークユニバーシティ
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/62 20060101AFI20240614BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】CRISPR/Cas9に基づく遺伝子活性化系および前記の系を使用する方法の提供。
【解決手段】本明細書で開示するのは、Cas9タンパク質とヒストンアセチル化酵素活性を有するタンパク質との融合タンパク質を含む、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子活性化系、および前記系を使用する方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
２つの異種のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第１のポリペプチドドメインは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ第２のポリペプチドドメインは、ヒストンアセチル化酵素活性を有するペプチドを含む、融合タンパク質。
続きを表示（約 800 文字）【請求項２】
標的遺伝子の転写を活性化する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１または配列番号１０を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドドメインが、ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインが、ｐ３００ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記第２のポリペプチドドメインが、配列番号２または配列番号３を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第１のポリペプチドドメインが、配列番号１または配列番号１０を含み、かつ前記第２のポリペプチドドメインが、配列番号２または配列番号３を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチドドメインが、配列番号１を含み、かつ前記第２のポリペプチドドメインが、配列番号３を含む、または、第１のポリペプチドドメインが、配列番号１を含み、かつ、前記第１のポリペプチドドメインが、配列番号１０を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、配列番号３を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，５６９号明細書に対する優先権を主張する。
続きを表示（約 2,600 文字）【０００２】
政府の権利の陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）によって拠出された連邦政府助成金第１Ｒ０１ＤＡ０３６８６５号に基づいて、政府支援の下で行われた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系および前記の系を使用する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
ヒトゲノム計画は、資金提供が行われ、ヒトゲノムの配列決定が、循環器疾患、神経変性状態、および糖尿病などの代謝疾患を含めた、強い遺伝性要素を有する複雑な疾患の遺伝的根拠を明らかにするであろうという前提に基づいて推進された。この情報が、これらの広範な疾患に対する新規の薬物標的をもたらすであろうと信じられていた。しかし、何千ものゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）が、これらの複雑な疾患と関係がある遺伝的変異が、遺伝子内に発生するのではなく特定の遺伝子のレベルを制御する遺伝子間調節領域において発生することを示している。同様に、メンデル遺伝病（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎｄｉｓｏｒｄｅｒ）のおよそ２０％は、検出可能なコード化変異を有さず、原因となる変異が遺伝子調節エレメント内にあることを示唆している。重要なことには、これらの調節エレメントに、機能的役割を割り当てることは非常に難しい。何故なら、これらの調節エレメントは、しばしば、その標的遺伝子から離れた位置に位置するからである。さらに、多くの遺伝子および調節エレメントは、ＧＷＡＳ研究ごとに、それぞれの陽性のヒットに分類される。実際には、ヒトゲノム計画に対するフォローアッププロジェクト、例えばＮＩＨ出資のＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＤＮＡＥｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ）およびＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔなどが、多くのヒト細胞型および組織について、ヒトゲノム全域の何百万もの推定上の調節エレメントを同定している。
【０００５】
ゲノム機能解析の最初の難関は、個々の遺伝子座でのゲノム機能を直接的かつ正確に操作する技術を発展させることである。ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓＰｒｏｊｅｃｔなどのプロジェクトは、多くのヒト細胞型および組織について、ヒトゲノム全域の何百万ものエピジェネティックマークを同定している。しかし、これらのマークの機能を研究することは、もっぱら遺伝子発現との統計的関連性に限られている。これらのエピジェネティック特性の直接操作のための技術は、こうした関連性に基づく発見を遺伝子調節の機構的原理に変換するために必須である。こうした進歩は、ゲノムの標的領域のエピジェネティックコードを改変する遺伝子治療、系譜特定のエピジェネティックリプログラミングに基づく再生医療および疾患モデリングのための戦略、およびエピゲノム特異的な薬物スクリーニングプラットフォームの設計をもたらす可能性があるので、人間の健康に利益を与える可能性を有する。
【０００６】
エピゲノムの操作は、細胞を、ヒストン脱アセチル酵素またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤などの小分子薬物で処理すること、または細胞を特定の系譜に分化させることによって可能である。しかし、小分子に基づく方法は、エピゲノムおよびトランスクリプトームを全体的に変化させ、個々の遺伝子座を標的にするのには適していない。エピゲノム修飾酵素と、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質との融合を含めたエピゲノム編集技術は、標的にされるＤＮＡメチル化、ＤＮＡヒドロキシメチル化、およびヒストン脱メチル化、メチル化、および脱アセチル化を達成するのに有効である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）のオリゴマーなどの活性化ドメインと融合されると、ｄＣａｓ９は、合成の転写調節因子として機能することができる。しかし、複数の活性化ドメインの必要性、または活性化ドメイン間の相乗効果によって高レベルの遺伝子導入を実現するためのｇＲＮＡの組み合わせの必要性を含めて、ｄＣａｓ９活性化因子の使用における制限は残ったままである。ＶＰ１６のテトラマーＶＰ６４などの、これらの遺伝子改変された転写因子において使用される、従来の活性化因子ドメインは、転写開始前複合体の複数の成分を動員するための骨格として機能し、クロマチン状態を特異的に調節する直接的な酵素機能は有しない。エピジェネティックリモデリングのこの間接的方法は、特定のエピジェネティックマークの役割を試験することを可能にせず、また、エピジェネティック状態の直接プログラミングほど強力ではない可能性がある。エピジェネティック特性の直接操作を目標にする能力の必要性が、依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、２つの異種のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第１のポリペプチドドメインが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、ヒストンアセチル化酵素活性を有するペプチドを含む、融合タンパク質を対象とする。
【０００９】
本発明は、先に記載した融合タンパク質と、少なくとも１種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、ＤＮＡターゲティング系を対象とする。
【００１０】
本発明は、細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する方法であって、この細胞を、ＤＮＡターゲティング系（ここでは、ＤＮＡターゲティング系は、先に記載したの融合タンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む）をコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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