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公開番号2024059642
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-01
出願番号2024013945,2021513265
出願日2024-02-01,2019-09-11
発明の名称肝臓疾患を検出する方法
出願人ザジェネラルホスピタルコーポレイション,プレジデントアンドフェローズオブハーバードカレッジ
代理人個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6886 20180101AFI20240423BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】慢性肝臓疾患患者において高精度で肝細胞癌腫などの肝臓疾患の存在を検出し、肝臓疾患の段階を決定するための非侵襲的方法を提供する。
【解決手段】循環上皮細胞の血中濃度ならびにその遺伝子発現に基づいて肝臓疾患および症状を診断、決定またはモニタリングする方法を開示する。
【選択図】図3-3
特許請求の範囲【請求項１】
対象の循環上皮細胞（ＣＥＣ）中の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）分類子遺伝子の発現レベルを
測定するステップを含む方法であって、前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ
２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮ
Ａ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１
、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１
、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上を含む
、方法。
続きを表示（約 3,000 文字）【請求項２】
前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２
ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、Ｃ
ＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳ
ＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１
ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＴＥＳＣ、ＯＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２
ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、Ｃ
ＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＳＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳ
ＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１
ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２からなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＣＣ分類子遺伝子が、ＡＣＴＧ２、ＡＤＭ２、ＡＦＰ、ＡＧＲ２、ＡＬＤＨ３Ａ
１、ＡＬＰＫ３、ＡＭＩＧＯ３、ＡＮＫＲＤ６５、ＡＮＬＮ、ＡＰ１Ｍ２、ＡＲＨＧＡＰ
１１Ａ、ＡＲＨＧＥＦ３９、ＡＳＦ１Ｂ、ＡＳＰＨＤ１、ＡＵＲＫＡ、ＡＸＩＮ２、ＢＡ
ＩＡＰ２Ｌ２、ＢＥＸ２、Ｃ１５ｏｒｆ４８、Ｃ１ｏｒｆ１０６、Ｃ１ＱＴＮＦ３、Ｃ６
ｏｒｆ２２３、ＣＡ１２、ＣＡ９、ＣＡＭＫ２Ｎ２、ＣＡＰ２、ＣＢＸ２、ＣＣＤＣ１７
０、ＣＣＤＣ２８Ｂ、ＣＣＤＣ６４、ＣＣＮＥ２、ＣＣＮＦ、ＣＤ１０９、ＣＤ３４、Ｃ
ＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ７、ＣＤＣＡ５、ＣＤＣＡ８、ＣＤＨ１３、ＣＤＫ１、ＣＤＫＮ２Ａ
、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＴ１、ＣＥＬＦ６、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＨ、ＣＥＮＰＬ、ＣＥＮ
ＰＵ、ＣＥＮＰＷ、ＣＫＢ、ＣＮＮＭ１、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ７Ａ１
、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＲＩＰ３、ＣＳＰＧ４、ＣＴＮＮＤ２、ＣＸｏｒｆ３６、ＣＹＰ１７
Ａ１、ＤＬＫ１、ＤＭＫＮ、ＤＳＣＣ１、ＤＴＬ、ＤＵＯＸ２、ＥＣＴ２、ＥＥＦ１Ａ２
、ＥＦＮＡ３、ＥＰＨＢ２、ＥＰＰＫ１、ＥＴＶ４、ＦＡＢＰ４、ＦＡＭ１１１Ｂ、ＦＡ
Ｍ３Ｂ、ＦＡＭ８３Ｄ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＩ、ＦＢＸＬ１８、ＦＥＲＭＴ１、ＦＧ
Ｆ１９、ＦＬＮＣ、ＦＬＶＣＲ１、ＦＯＸＤ２－ＡＳ１、ＦＯＸＭ１、ＦＸＹＤ２、ＧＡ
ＢＲＥ、ＧＡＬ３ＳＴ１、ＧＣＮＴ３、ＧＩＮＳ１、ＧＪＣ１、ＧＭＮＮ、ＧＮＡＺ、Ｇ
ＯＬＧＡ２Ｐ７、ＧＰＣ３、ＧＰＲ６４、ＧＰＳＭ１、ＨＲＣＴ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、Ｉ
ＧＳＦ１、ＩＧＳＦ３、ＩＱＧＡＰ３、ＩＴＧＡ２、ＩＴＰＫＡ、ＫＩＡＡ０１０１、Ｋ
ＩＦ１１、ＫＩＦＣ１、ＫＩＦＣ２、ＫＮＴＣ１、ＫＲＴ２３、ＬＡＭＡ３、ＬＥＦ１、
ＬＧＲ５、ＬＩＮＣ００１５２、ＬＩＮＧＯ１、ＬＰＬ、ＬＲＲＣ１、ＬＹＰＤ１、ＭＡ
Ｄ２Ｌ１、ＭＡＧＥＤ４、ＭＡＧＥＤ４Ｂ、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ８ＩＰ２、ＭＡＰＴ
、ＭＣＭ２、ＭＤＧＡ１、ＭＤＫ、ＭＦＡＰ２、ＭＩＳＰ、ＭＫＩ６７、ＭＭＰ１１、Ｍ
ＮＳ１、ＭＰＺ、ＭＳＣ、ＭＳＨ５、ＭＴＭＲ１１、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＹＨ４
、ＮＡＡＬＡＤＬ１、ＮＡＶ３、ＮＣＡＰＧ、ＮＤＵＦＡ４Ｌ２、ＮＥＢ、ＮＫＤ１、Ｎ
ＭＢ、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＵＭ、ＮＰＭ２、ＮＱＯ１、ＮＲＣＡＭ、ＮＴ５ＤＣ２、Ｎ
ＴＳ、ＯＢＳＣＮ、ＯＬＦＭＬ２Ａ、ＯＬＦＭＬ２Ｂ、ＰＡＱＲ４、ＰＥＧ１０、ＰＩ３
、ＰＬＣＥ１、ＰＬＣＨ２、ＰＬＫ１、ＰＬＸＤＣ１、ＰＯＤＸＬ２、ＰＯＬＥ２、ＰＰ
ＡＰ２Ｃ、ＰＲＣ１、ＰＴＧＥＳ、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＨＬＨ、ＰＴＫ７、ＰＴＰ４Ａ３、
ＰＴＴＧ１、ＰＹＣＲ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＲＢＭ２４、ＲＨＢＧ、ＲＮＦ１５７、ＲＯ
ＢＯ１、ＲＰ４－８００Ｇ７．２、ＲＰＳ６ＫＬ１、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１、ＳＣＧＮ
、５－Ｓｅｐ、ＳＥＲＰＩＮＡ１２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＦＮ、ＳＧＯＬ２、ＳＬＣ２２Ａ
１１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＮＣＧ、ＳＯＡＴ２、ＳＰ５、ＳＰＡＲＣＬ１、
ＳＰＩＮＫ１、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ３９、ＳＵＬＴ１Ｃ２、ＴＣＦ１９、ＴＤＧＦ１、ＴＨ
Ｙ１、ＴＫ１、ＴＭＣ５、ＴＭＥＭ１３２Ａ、ＴＭＥＭ１５０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１９、Ｔ
ＮＦＲＳＦ２５、ＴＯＮＳＬ、ＴＰＸ２、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＴＲＩＭ３１
、ＴＲＩＭ４５、ＴＴＣ３９Ａ、ＵＢＤ、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＧＴ２Ｂ１１、Ｕ
ＳＨ１Ｃ、ＶＳＩＧ１０Ｌ、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ７６、およびＺＷＩＮＴからなる群から
選択される１つ、２つ、３つ以上の追加的な遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法
。
【請求項５】
慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）を有する対象においてＨＣＣの存在を検出する方法であって、
（ａ）前記対象のＣＥＣにおいて請求項１～４のいずれか一項に記載のＨＣＣ分類子遺伝
子の発現レベルを測定するステップと；
（ｂ）前記対象のＣＥＣ中の前記ＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルをＨＣＣ分類子遺
伝子の参照発現レベルと比較し、それによってＨＣＣの存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項６】
ＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルを使用してＨＣＣスコアが算出され、前記算出さ
れたＨＣＣスコアが参照スコアと比較され、ＨＣＣの存在が、前記参照スコアより高いＨ
ＣＣスコアの存在に基づいて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＣＣスコアが、ランダムフォレスト分析を使用して算出される、請求項６に記載
の方法。
【請求項８】
ＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルが、多変量ロジスティック回帰モデル化手法を使
用してＨＣＣ分類子遺伝子の前記参照発現レベルと比較される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
循環上皮細胞（ＣＥＣ）中のＨＣＣ分類子遺伝子の前記発現レベルが：
（ａ）前記対象から血液を含む試料を得るステップと；
（ｂ）サイズに基づく排除によって前記試料から赤血球、血小板および血漿を除去するス
テップと；
（ｃ）磁気泳動によって前記試料から白血球（ＷＢＣ）を除去するステップと；
（ｄ）ＲＮＡ配列決定、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーショ
ン、タンパク質マイクロアレイ、または質量分析およびタンパク質プロファイリングを使
用して前記ＣＥＣ中の一組の遺伝子の発現を測定するステップと
によって測定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出される前記ＨＣＣが、早期段階のＨＣＣである、請求項５～９のいずれか一項に記
載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号ＤＫ００７１９１、ＥＢ０１
２４９３、ＣＡ１７２７３８およびＤＫ０７８７７２の下で政府支援により行われた。政
府は、本発明に一定の権利を有する。
続きを表示（約 2,100 文字）【０００２】
本発明は、循環上皮細胞（ＣＥＣ）を単離し、分析することによって対象において肝臓
疾患を検出し、特徴付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体生検とは、実質器官に由来し、血流に入った細胞物質を試料採取することを指す。
循環上皮細胞（ＣＥＣ）は、限局性がんの環境（Stott SL, et al. Sci Transl Med 2010
;2:25ra23; Lucci A, et al. Lancet Oncol 2012;13:688-95）および新生物発生前の膵臓
病変でも（Rhim AD, et al. Gastroenterology 2014;146:647-51; Franses JW, et al. O
ncologist 2017）液体生検によって検出され得、その存在は、発癌現象に限定されないこ
とを示唆している。
【０００４】
ＣＥＣの単離は、血流中のその希少性、および細胞捕捉に使用される抗原の多様な発現
のため技術的な難題である。例えば、ＥｐＣＡＭ依存的なＶｅｒｉｄｅｘプラットフォー
ムは、２つの独立した研究において肝細胞癌腫（ＨＣＣ）ＣＥＣ検出率３５％および４１
％しかなかった（Kelley RK, et al. BMC Cancer 2015;15:206; Sun YF, et al. Hepatol
ogy 2013;57:1458-68）。この制約を克服するために、細胞生存率および高品質のＲＮＡ
内容物を保ちながらＣＥＣを単離するｉＣｈｉｐと呼ばれる抗原非依存的細胞選別デバイ
スが開発された。ＨＣＣにおけるＣＥＣを富化し、検出するアッセイを作製するためにｉ
Ｃｈｉｐデバイスは、確立されている肝臓特異的マーカーに基づくＲＮＡシグネチャーと
これまで組み合わされてきた（Kalinich M, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2017;114:1
123-1128）。
【０００５】
ＨＣＣの非侵襲的診断のための他の手法は、高い検出率を達成するのに失敗してきた。
例えば、最近の研究は、無細胞ＤＮＡと血液に基づくタンパク質バイオマーカーとを組み
合わせることによるＨＣＣの検出が、おそらく一般的な反復突然変異およびＨＣＣに固有
の特異的タンパク質マーカーの不足のためＨＣＣの予測について４４％の精度しかもたら
さなかったことを示している（Cohen JD, et al. Science 2018を参照）。
【０００６】
非侵襲的方法を使用することによる特定の肝臓疾患の診断における別の難題は、ＣＥＣ
が異なる２つの疾患に存在し得るため、ＣＥＣの定量分析が２つの疾患同士を区別するの
に必要な情報を提供し得ないことである。
【０００７】
現在まで、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）がある対象においてＨＣＣなどの肝臓疾患を正確に
検出する、または異なる肝臓疾患同士もしくは異なる段階の肝臓疾患同士を区別するため
に利用可能な非侵襲的な血液に基づく方法は存在しない。
【０００８】
したがって、ＣＬＤ患者において高精度でＨＣＣなどの肝臓疾患の存在を検出し、肝臓
疾患の段階を決定するための非侵襲的方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、少なくとも一部において、肝ＣＥＣ（ｈＣＥＣ）が、発癌現象に限定されず
、慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）などの非がん疾患または症状を有する対象にも存在し得るとい
う発見に基づく。さらに、本発明は、少なくとも一部において、ＣＬＤの対象においてｈ
ＣＥＣを定量的または定性的に分析して、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）などのがんの存在を正確
に検出しおよび／または肝臓線維症などの肝臓疾患もしくは症状の異なる段階（例えば、
早期または後期段階）を正確に特徴付け得るという発見に基づく。
【００１０】
一態様において、本発明は、対象の循環上皮細胞（ＣＥＣ）中の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）
分類子遺伝子の発現レベルを測定する方法に関し、ＨＣＣ分類子遺伝子は、ＴＥＳＣ、Ｏ
ＳＢＰ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＥＰＴ５、Ｆ２ＲＬ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＺＨ２、ＣＤＣ２０、
ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＢ１、ＰＬＸＮＢ３、ＣＤＣ６、ＭＹＢＬ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、Ｓ
ＰＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＴＯＰ２Ａ、ＡＳＰＭ、ＳＬＣ６Ａ９、ＲＥＣＱＬ４、ＮＵＳ
ＡＰ１、ＰＬＶＡＰ、ＦＭＯ１、ＰＤＺＫ１ＩＰ１およびＦＢＸＯ３２のうちの１つ以上
を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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