特許ウォッチ

公開番号2024038140
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-03-19
出願番号2023220226,2020544428
出願日2023-12-27,2019-02-22
発明の名称ブタトリプシンの変異体
出願人サノフィ-アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 15/57 20060101AFI20240312BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ブタトリプシンのポリペプチド変異体、これらの変異体をコードする核酸分子、およびかかる核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【解決手段】ブタトリプシンの変異体であって、特定の配列で表される、天然ブタトリプシンと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはそれからなり、該アミノ酸配列は、前記特定の配列で表される、天然ブタトリプシンのF24、S44、D56、G78、Y131、S172およびW193に対応する1つまたはそれ以上の位置での少なくとも1個またはそれ以上のアミノ酸置換を含有し、但し、該アミノ酸配列は、前記特定の配列による天然ブタトリプシンではないことを条件とし;かつ、該アミノ酸配列は、別の特定の配列によるブタ変異体トリプシンS172Aではないことを条件とする、前記ブタトリプシンの変異体を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ブタトリプシンの変異体であって、
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みまたはそれからなり、
該アミノ酸配列は、配列番号１による天然ブタトリプシンのＦ２４、Ｓ４４、Ｄ５６、Ｇ７８、Ｙ１３１、Ｓ１７２およびＷ１９３に対応する１つまたはそれ以上の位置での少なくとも１個またはそれ以上のアミノ酸置換がある点が配列番号１と異なり；但し、
該アミノ酸配列は、配列番号１による天然ブタトリプシンではないことを条件とし；かつ、
該アミノ酸配列は、配列番号２によるブタ変異体トリプシンＳ１７２Ａではないことを条件とする、
前記ブタトリプシンの変異体。
続きを表示（約 3,700 文字）【請求項２】
Ｆ２４に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｓ４４に対応する位置のアミノ酸は、ＬｅｕおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｄ５６に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、およびＴｒｐからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｇ７８に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｙ１３１に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｓ１７２に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、およびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；ならびに／または
Ｗ１９３に対応する位置のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、
請求項１に記載のブタトリプシンの変異体。
【請求項３】
前記アミノ酸配列は、配列番号１による天然ブタトリプシンのＲ９９、Ｒ１０７、Ｋ１２５、およびＫ１７０に対応する１つまたはそれ以上の位置での少なくとも１個またはそれ以上のアミノ酸置換がある点が配列番号１とはさらに異なる、請求項１または２に記載のブタトリプシンの変異体。
【請求項４】
Ｒ９９に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｒ１０７に対応する位置のアミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
Ｋ１２５に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；ならびに／または
Ｋ１７０に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、
請求項３に記載のブタトリプシンの変異体。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は配列番号３であり、ここで、
－Ｘａａ２４は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ４４は、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ５６は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、およびＴｒｐからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ７８は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ９９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ１０７は、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ１２５は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ１３１は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ１７０は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；
－Ｘａａ１７２は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；ならびに／または
－Ｘａａ１９３は、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択されるアミノ酸であり；但し、
配列番号３は、配列番号１によるブタ野生型トリプシンではないことを条件とし；かつ
配列番号３は、配列番号２によるブタ変異体トリプシンＳ１７２Ａではないことを条件とする、
請求項１～４のいずれか１項に記載のブタトリプシンの変異体。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、および配列番号１１９
からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のブタトリプシンの変異体。
【請求項７】
（ｉ）前記変異体は、一般式Ａ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｂを有するペプチドを切断して、少なくとも８０％の収率で、一般式Ａ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇの切断産物を生じることができ、
Ａは１個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；かつ
Ｂは１個またはそれ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列である；かつ／または
（ｉｉ）該変異体は、配列番号２によるブタ変異体トリプシンＳ１７２Ａと比較して、Ｂ３２－Ａｒｇ位のＣ末端側の位置での、プレプロヒトインスリン、プレプロインスリングラルギン、プレプロインスリンリスプロ、プレプロインスリンアスパルト、またはプレプロインスリングルリジンの切断に対して向上した選択性を呈する、
請求項１～６のいずれか１項に記載のブタトリプシンの変異体。
【請求項８】
核酸分子であって、
－請求項１～７のいずれか１項に記載のブタトリプシンの変異体、または
－請求項１～７のいずれか１項に記載のブタトリプシンの変異体のトリプシノーゲン前駆体分子
をコードし、
ベクターに場合により含有されるか、またはゲノムに場合により組み込まれている前記核酸分子。
【請求項９】
宿主細胞であって、請求項８に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１～７のいずれか１項に記載のブタトリプシンの変異体を産生する方法であって：
請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程；および
培養培地からまたは該宿主細胞からブタトリプシンの該変異体のトリプシノーゲン前駆体分子を単離する工程、ならびに
場合により、該トリプシノーゲン前駆体分子を活性化し、それによりブタトリプシンの該変異体を得る工程
を含む前記方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタトリプシンのペプチド変異体に、これら変異体をコードする核酸分子に、およびかかる核酸分子を含む宿主細胞に関する。本発明はまた、インシュリンを産生するための方法におけるこれら変異体の使用にも関する。本発明はさらに、医薬としての、食品成分としての、または飼料成分としてのこれら変異体の使用に、および、食品成分または飼料成分を製造する方法中でのこれら変異体の使用に関する。
続きを表示（約 2,000 文字）【背景技術】
【０００２】
エンドペプチダーゼトリプシンは、ヒトインスリン、インスリンアナログの、およびまたインスリン誘導体の製造向けに使用される。ヒトインスリン、インスリンアナログ、またはインスリン誘導体は、トリプシンを使用して酵素加水分解によってプレプロインスリン（ＰＰＩ）から生成され、この場合、プレ配列およびＣペプチドが、それぞれの産物を得るために切断される（図１を参照されたい）。トリプシンは、ポリペプチド鎖内のＡｒｇ残基およびＬｙｓ残基のＣ末端側で切断するのに特異的である。プレプロヒトインスリンおよびプレプロインスリングラルギンポリペプチド内には、Ｂ鎖とＣペプチドとの接合部でのＢ２９Ｌｙｓ、Ｂ３１Ａｒｇ、およびＢ３２Ａｒｇを含めて、いくつかのＡｒｇ残基およびＬｙｓ残基が存在する。したがって、プレプロヒトインスリンおよびプレプロインスリングラルギンは、Ｂ２９ＬｙｓおよびＢ３１ＡｒｇおよびＢ３２ＡｒｇのＣ末端側を含めて、Ａｒｇ残基およびＬｙｓ残基のＣ末端側でトリプシンによって切断される。インスリングラルギンの製造の場合、Ｂ３２Ａｒｇの後のトリプシン切断により最終的なインスリングラルギンが提供される。Ｂ２９ＬｙｓおよびＢ３１Ａｒｇの後のトリプシン切断によって、副産物ｄｅｓＢ３０－Ｔｈｒ（「ｄｅｓ－Ｔｈｒ」）－インスリングラルギンおよびｄｅｓＢ３２Ａｒｇ－インスリングラルギン（「ｄｅｓ－Ａｒｇ」とも呼ばれる）がもたらされる。したがって、インスリングラルギンの製造方法で副産物を除去する必要がある。
【０００３】
ヒトインスリンの製造の場合、Ｂ３１Ａｒｇの後のトリプシン切断によりＢ３１Ａｒｇ－ヒトインスリン（「モノ－Ａｒｇ」とも呼ばれる）が、Ｂ３２Ａｒｇの後のトリプシン切断によりＢ３１Ａｒｇ－Ｂ３２Ａｒｇ－ヒトインスリン（「ジ－Ａｒｇ」とも呼ばれる）が、もたらされる。どちらも前記製造方法の中間体である。その後の製造方法では、これら２つの中間体は両方とも最終的なヒトインスリンに変換される。Ｂ２９Ｌｙｓの後のトリプシン切断により、副産物のｄｅｓＢ３０－Ｔｈｒ（「ｄｅｓ－Ｔｈｒ」）－ヒトインスリンがもたらされる。したがって、ヒトインスリンの製造方法で副産物を除去する必要がある。
【０００４】
ヒトインスリンおよびインスリングラルギンの製造の場合、Ｂ３２Ａｒｇの後のトリプシン切断により最終的なインスリングラルギンがもたらされ、ヒトインスリンの場合、Ｂ３２Ａｒｇの後のトリプシン切断により中間体がもたらされ、これは、後続の工程段階において最終的なヒトインスリンに変換される。
【０００５】
ｄｅｓＢ３０－Ｔｈｒ－中間体の望ましくない形成に対処するために、過去の開発により、Ａｒｇ対ＬｙｓのＣ末端側に対する選択性が高いことにより、この誤切断を低減させるブタトリプシン変異体Ｓ１７２Ａがもたらされた。ブタトリプシン変異体Ｓ１７２Ａは、その全体が参照によって本明細書に組み入れる、特許文献１に記載されている。
【０００６】
ここで、発明者らは、トリプシンＳ１７２Ａ触媒反応の速度論を注意深く観察したところ、驚くべきことに、誤切断された副産物の形成は、文献に記載されているようなエンド
プロテアーゼとして作用するトリプシンによるＰＰＩの主な誤切断に起因するだけでなく、エキソペプチダーゼとして作用するブタトリプシンならびにその変異体Ｓ１７２Ａに内在するサイドアクティビティ（ｓｉｄｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ）にも起因するであろうことを見いだした。エキソペプチダーゼ活性によって、ｄｅｓ－Ａｒｇおよびｄｅｓ－Ｔｈｒの形成の下でインスリングラルギンの分解がもたらされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
国際特許出願ＷＯ２００７／０３１１８７Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の基礎をなす技術上の問題
したがって、先行技術において、サイドアクティビティが低減した、特にエキソペプチダーゼ活性が低減した新規なトリプシン変異体に対するニーズがあった。かかる新規なトリプシン変異体は、ＰＰＩの切断において副産物の量を低減し、ＰＰＩからインスリン（またはインスリン誘導体）を産生するときに、インスリンおよびインスリン誘導体の収率がより向上するという結果をもたらすであろう。
【０００９】
本発明者らは、エキソペプチダーゼ活性の低減を有する、および／またはＰＰＩ切断反応において副産物の形成の低減を示す、ブタトリプシンの新規な変異体を製造した。
【００１０】
上のあらましは、本発明によって解決される問題すべてを必ずしも説明するものではない。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許