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公開番号2024019511
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-02-09
出願番号2023209479,2019174877
出願日2023-12-12,2019-09-26
発明の名称がんにおける融合遺伝子
出願人静岡県,株式会社エスアールエル
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20240202BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】がん治療ターゲットとなり得るバイオマーカーを提供すること。
【解決手段】被験者から採取された生体試料中に、MGEA5-RET融合タンパク質等の本件融合タンパク質、MGEA5-RET融合遺伝子等の本件融合遺伝子が存在するか否かを検出し、その存在が確認された被験者(すなわち、がん患者)に対して、本件融合タンパク質の発現又は生理活性を抑制する物質を投与すると、がん治療が可能となる。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の工程（ａ）を含むことを特徴とするがんにおける融合遺伝子の検出方法。
（ａ）被験者から採取された生体試料中の、以下の［融合タンパク質群］から選択される１又は２以上の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、以下の表１に示す［下流側の遺伝子断片のｃＤＮＡ］のいずれかにアニーリングし、かつ融合部位を増幅できる１又は２以上のリバースプライマーを用いて検出する工程；
［融合タンパク質群］
ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質
ＴＢＣ１Ｄ５－ＬＰＰ融合タンパク質
ＡＣＥＲ１－ＭＬＬＴ１融合タンパク質
ＮＡＢ２－ＳＴＡＴ６融合タンパク質
ＰＯＵ２Ｆ１－ＭＡＭＬ２融合タンパク質
ＴＭＥＭ４１Ｂ－ＦＵＳ融合タンパク質
ＺＤＨＨＣ２１－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＬＡＣＡＴ１－ＳＥＰＴ９融合タンパク質
ＥＩＦ３Ｋ－ＡＣＴＮ４融合タンパク質
ＳＬＣ１２Ａ２－ＲＥＴ融合タンパク質
ＧＳＫ３Ｂ－ＧＰＨＮ融合タンパク質
ＩＬ６ＳＴ－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＰＰＰ１ＣＢ－ＡＬＫ融合タンパク質
ＲＮＦ４０－ＣＵＴＡ融合タンパク質
（ＳＥＰＴ５－ＧＰ１ＢＢ）－ＳＥｐｔ５融合タンパク質
ＰＲＩＭ２－ＡＣＴＢ融合タンパク質
ＡＺＩＮ１－ＭＬＬＴ３融合タンパク質
ＲＡＰ１Ｂ－ＨＭＧＡ２融合タンパク質
ＥＺＲ－ＭＬＬＴ４融合タンパク質
ＯＧＴ－ＡＦＦ１融合タンパク質
ＲＰＳＡＰ５２－ＨＭＧＡ２融合タンパク質
ＢＣＬ１１Ｂ－ＬＯＣ１０５３７０６５９融合タンパク質
ＬＯＣ１０１９２８８６５－ＧＡＢ２融合タンパク質
ＡＱＰ１０－ＡＴＰ８Ｂ２融合タンパク質
ＡＲＭＣ２－ＦＯＸＯ３融合タンパク質
ＣＢＬ－ＭＡＭＬ２融合タンパク質
ＰＲＫＣＱ－ＰＩＣＡＬＭ融合タンパク質
ＦＧＦ１－ＰＲＫＡＲ２Ａ融合タンパク質
ＳＬＣ４４Ａ１－ＢＲＡＦ融合タンパク質
ＳＭＵＲＦ１－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＴＣＡＦ１－ＢＲＡＦ融合タンパク質
ＣＣＮＣ－ＭＬＬＴ１０融合タンパク質
ＰＰＰ１Ｒ２１－ＡＬＫ融合タンパク質
ＬＯＣ１０７９８６４５７－ＡＲＨＧＡＰ２６融合タンパク質
ＳＰＴＢＮ１－ＡＬＫ融合タンパク質
ＭＫＲＮ２－ＰＰＡＲＧ融合タンパク質
ＰＨＬＤＢ２－ＪＡＫ２融合タンパク質
ＳＭＡＲＣＡ２－ＮＦＩＢ融合タンパク質
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続きを表示（約 4,100 文字）【請求項２】
以下の［融合タンパク質群］から選択される１又は２以上の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡにアニーリングするフォワードプライマー及びリバースプライマーのプライマーセット、又は前記ｃＤＮＡにハイブリダイズするプローブを含む、がんにおける融合遺伝子の検出用キットであって、
前記リバースプライマーが、以下の表２に示す［下流側の遺伝子断片のｃＤＮＡ］のいずれかにアニーリングし、かつ融合部位を増幅できる１又は２以上のリバースプライマーである、前記検出用キット。
［融合タンパク質群］
ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質
ＴＢＣ１Ｄ５－ＬＰＰ融合タンパク質
ＡＣＥＲ１－ＭＬＬＴ１融合タンパク質
ＮＡＢ２－ＳＴＡＴ６融合タンパク質
ＰＯＵ２Ｆ１－ＭＡＭＬ２融合タンパク質
ＴＭＥＭ４１Ｂ－ＦＵＳ融合タンパク質
ＺＤＨＨＣ２１－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＬＡＣＡＴ１－ＳＥＰＴ９融合タンパク質
ＥＩＦ３Ｋ－ＡＣＴＮ４融合タンパク質
ＳＬＣ１２Ａ２－ＲＥＴ融合タンパク質
ＧＳＫ３Ｂ－ＧＰＨＮ融合タンパク質
ＩＬ６ＳＴ－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＰＰＰ１ＣＢ－ＡＬＫ融合タンパク質
ＲＮＦ４０－ＣＵＴＡ融合タンパク質
（ＳＥＰＴ５－ＧＰ１ＢＢ）－ＳＥｐｔ５融合タンパク質
ＰＲＩＭ２－ＡＣＴＢ融合タンパク質
ＡＺＩＮ１－ＭＬＬＴ３融合タンパク質
ＲＡＰ１Ｂ－ＨＭＧＡ２融合タンパク質
ＥＺＲ－ＭＬＬＴ４融合タンパク質
ＯＧＴ－ＡＦＦ１融合タンパク質
ＲＰＳＡＰ５２－ＨＭＧＡ２融合タンパク質
ＢＣＬ１１Ｂ－ＬＯＣ１０５３７０６５９融合タンパク質
ＬＯＣ１０１９２８８６５－ＧＡＢ２融合タンパク質
ＡＱＰ１０－ＡＴＰ８Ｂ２融合タンパク質
ＡＲＭＣ２－ＦＯＸＯ３融合タンパク質
ＣＢＬ－ＭＡＭＬ２融合タンパク質
ＰＲＫＣＱ－ＰＩＣＡＬＭ融合タンパク質
ＦＧＦ１－ＰＲＫＡＲ２Ａ融合タンパク質
ＳＬＣ４４Ａ１－ＢＲＡＦ融合タンパク質
ＳＭＵＲＦ１－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＴＣＡＦ１－ＢＲＡＦ融合タンパク質
ＣＣＮＣ－ＭＬＬＴ１０融合タンパク質
ＰＰＰ１Ｒ２１－ＡＬＫ融合タンパク質
ＬＯＣ１０７９８６４５７－ＡＲＨＧＡＰ２６融合タンパク質
ＳＰＴＢＮ１－ＡＬＫ融合タンパク質
ＭＫＲＮ２－ＰＰＡＲＧ融合タンパク質
ＰＨＬＤＢ２－ＪＡＫ２融合タンパク質
ＳＭＡＲＣＡ２－ＮＦＩＢ融合タンパク質
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【請求項３】
以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むことを特徴とするがんに関連する融合遺伝子のｃＤＮＡを合成する方法。
（Ａ）がんに関連する融合遺伝子のデータベースから、以下の（１）～（５）の条件を満たす融合遺伝子を選択する工程；
（１）融合遺伝子のＤＮＡ配列情報が明らかにされている；
（２）培養細胞中に存在することが知られている融合遺伝子ではない；
（３）異なる２つの遺伝子断片が融合した融合遺伝子である；
（４）融合部位が１つの融合遺伝子である；
（５）ゲノムＤＮＡ上の位置が特定されている融合遺伝子である；
（Ｂ）がん患者から採取された生体試料中のｍＲＮＡを基に、上流側末端及び／又は下流側末端にアダプターが付加されたｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡの上流側末端に付加されたアダプターにアニーリングするフォワードプライマーと、工程（Ａ）において選択した融合遺伝子のうち、下流側の遺伝子断片のｃＤＮＡにアニーリングするリバースプライマーとを用いて、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応を行うか、あるいは
工程（Ａ）において選択した融合遺伝子のうち、上流側の遺伝子断片のｃＤＮＡにアニーリングするフォワードプライマーと、工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡの下流側末端に付加されたアダプターにアニーリングするリバースプライマーとを用いて、ＰＣＲを行う工程；
【請求項４】
リバースプライマーが、以下の表３に示す［下流側の遺伝子断片のｃＤＮＡ］のいずれかにアニーリングし、かつ融合部位を増幅できる１又は２以上のリバースプライマーであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
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【請求項５】
工程（Ａ）において、少なくとも７００種類の融合遺伝子を選択することを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡの上流側末端に付加されたアダプターにアニーリングするフォワードプライマーと、工程（Ａ）において選択した融合遺伝子のうち、下流側の遺伝子断片のｃＤＮＡにアニーリングするリバースプライマーとを用いて、ＰＣＲを行うことを特徴とする請求項３～５のいずれかに記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんに伴う遺伝子融合が生じているか否かを検出する方法；がんに伴う遺伝子融合が生じているか否かを検出するためのキット；がんを治療するための製剤；融合タンパク質に対する抗体；融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とするポリヌクレオチド；融合タンパク質若しくはその断片、又は、それらをコードするｃＤＮＡ；がんに関連する融合遺伝子のｃＤＮＡを合成する方法；等に関する。
続きを表示（約 3,800 文字）【背景技術】
【０００２】
融合遺伝子は、染色体転座により異なる２つの遺伝子が融合することにより生じる。融合遺伝子は、がん化の原因の１つであることから、融合遺伝子を同定し、同定した融合遺伝子に対する分子標的薬を用いたがんの個別化医療が行われている。
【０００３】
ＲＥＴ（rearrangedduring transfection）遺伝子は、１０番染色体長腕のセントロメ
ア付近に存在し、２１個のエクソンからなる遺伝子である。ＲＥＴ遺伝子がコードするタンパク質は、受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有する。カルボキシル末端のスプライシングの違いにより１０７２アミノ酸（ＲＥＴ９）、１１０６アミノ酸（ＲＥＴ４３）、１１１４アミノ酸（ＲＥＴ５１）の３種類のタンパク質が存在することが知られている。ＲＥＴはリガンド／ＧＦＲ複合体を介して二量体を形成することで自己のチロシンをリン酸化し活性化する。
【０００４】
甲状腺乳頭がんにおいて、染色体内逆位又は染色体間転座により、ＲＥＴ遺伝子が他の遺伝子（Ｈ４、ＥＬＥ１など）と融合した結果、がん化能を有する融合型チロシンキナーゼＲＥＴ－ＰＴＣが発現していることが報告されている（非特許文献１）。ＲＥＴの融合パートナー分子の多くは、複合体形成ドメインを有していることから、ＲＥＴとの融合タンパク質自身も複合体を形成していると考えられており、この複合体形成がＲＥＴのチロシンキナーゼ活性の恒常的な自己リン酸化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され、がん化や細胞増殖を惹き起こしていると考えられている（非特許文献１）。実際に、ＲＥＴ－ＰＴＣ融合遺伝子をマウス正常細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入すると、がん細胞様に形質転換すること、さらにはＲＥＴキナーゼ抑制化合物がＲＥＴ－ＰＴＣ融合遺伝子を発現した甲状腺がん細胞株の細胞増殖を抑制できることから、ＲＥＴ－ＰＴＣ融合タンパク質は、甲状腺がんの治療標的分子となることが示されている（非特許文献２～４）。さらに、非小細胞肺がん患者において、ＫＩＦ５Ｂ－ＲＥＴ融合遺伝子が発現しているとの報告や（特許文献１）、細気管支肺細胞がん患者において、ＰＩＢＦ１－ＲＥＴ融合遺伝子が発現しているとの報告がある（特許文献２）。
【０００５】
一方、ＭＧＥＡ５（MeningiomaExpressed Antigen 5）は、タンパク質のセリン／スレオニン残基のＯ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ）修飾を除く酵素であり、脳と膵臓では特に発現が高いことが知られている。ＭＧＥＡ５は、主に細胞質に存し、ヒストンアセチル転移酵素も備わっている。しかしながら、ＭＧＥＡ５遺伝子が、ＲＥＴ遺伝子等の遺伝子と融合することや、がんと関連することについては、これまで報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２０１２／０１４７９５号パンフレット
特開２０１５－１０９８０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
Eur J Endocrinol.2006 Nov;155(5):645-53.
CancerRes. 2002 Dec 15;62(24):7284-90.
J Clin Endocrinol Metab. 2006Oct;91(10):4070-6.
J BiolChem. 2007 Oct 5;282(40):29230-40.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、がん治療ターゲットとなり得るバイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、がん組織４０００症例から全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した後、後述する本実施例１に記載の方法を用いて融合遺伝子の検出を行った。その結果、大腸がん組織試料中に、ＭＧＥＡ５遺伝子と、ＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子（すなわち、ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合遺伝子）が存在することが確認された。また、ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合遺伝子のｃＤＮＡを同定し、ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合遺伝子におけるブレイクポイントも特定した。さらに、様々ながん組織試料を用いて同様の方法で解析を行った結果、ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合遺伝子以外にも３７種類の新規融合遺伝子を同定した。ＲＥＴとの融合遺伝子や、当該融合遺伝子がコードするタンパク質は、前述のとおり、がんを誘発するとともに、がんの治療標的分子となることが知られている。このことから、本発明の融合遺伝子や本発明の融合遺伝子がコードするタンパク質（例えば、ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質やＳＬＣ１２Ａ２－ＲＥＴ融合タンパク質）は、がんの治療標的分子となることが十分期待される。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）を含むことを特徴とするがんにおける融合遺伝子の検出方法。
（ａ）被験者から採取された生体試料中の、以下の［融合タンパク質群］から選択される１又は２以上の融合タンパク質（以下、「本件融合タンパク質」ということがある）、又は該融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、若しくはｃＤＮＡを検出する工程；
［融合タンパク質群］
ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質
ＴＢＣ１Ｄ５－ＬＰＰ融合タンパク質
ＡＣＥＲ１－ＭＬＬＴ１融合タンパク質
ＮＡＢ２－ＳＴＡＴ６融合タンパク質
ＰＯＵ２Ｆ１－ＭＡＭＬ２融合タンパク質
ＴＭＥＭ４１Ｂ－ＦＵＳ融合タンパク質
ＺＤＨＨＣ２１－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＬＡＣＡＴ１－ＳＥＰＴ９融合タンパク質
ＥＩＦ３Ｋ－ＡＣＴＮ４融合タンパク質
ＳＬＣ１２Ａ２－ＲＥＴ融合タンパク質
ＧＳＫ３Ｂ－ＧＰＨＮ融合タンパク質
ＩＬ６ＳＴ－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＰＰＰ１ＣＢ－ＡＬＫ融合タンパク質
ＲＮＦ４０－ＣＵＴＡ融合タンパク質
（ＳＥＰＴ５－ＧＰ１ＢＢ）－ＳＥｐｔ５融合タンパク質
ＰＲＩＭ２－ＡＣＴＢ融合タンパク質
ＡＺＩＮ１－ＭＬＬＴ３融合タンパク質
ＲＡＰ１Ｂ－ＨＭＧＡ２融合タンパク質
ＥＺＲ－ＭＬＬＴ４融合タンパク質
ＯＧＴ－ＡＦＦ１融合タンパク質
ＲＰＳＡＰ５２－ＨＭＧＡ２融合タンパク質
ＢＣＬ１１Ｂ－ＬＯＣ１０５３７０６５９融合タンパク質
ＬＯＣ１０１９２８８６５－ＧＡＢ２融合タンパク質
ＡＱＰ１０－ＡＴＰ８Ｂ２融合タンパク質
ＡＲＭＣ２－ＦＯＸＯ３融合タンパク質
ＣＢＬ－ＭＡＭＬ２融合タンパク質
ＰＲＫＣＱ－ＰＩＣＡＬＭ融合タンパク質
ＦＧＦ１－ＰＲＫＡＲ２Ａ融合タンパク質
ＳＬＣ４４Ａ１－ＢＲＡＦ融合タンパク質
ＳＭＵＲＦ１－ＦＯＸＯ１融合タンパク質
ＴＣＡＦ１－ＢＲＡＦ融合タンパク質
ＣＣＮＣ－ＭＬＬＴ１０融合タンパク質
ＰＰＰ１Ｒ２１－ＡＬＫ融合タンパク質
ＬＯＣ１０７９８６４５７－ＡＲＨＧＡＰ２６融合タンパク質
ＳＰＴＢＮ１－ＡＬＫ融合タンパク質
ＭＫＲＮ２－ＰＰＡＲＧ融合タンパク質
ＰＨＬＤＢ２－ＪＡＫ２融合タンパク質
ＳＭＡＲＣＡ２－ＮＦＩＢ融合タンパク質
〔２〕融合タンパク質が、ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質である、上記〔１〕に記載の検出方法であって、
（i）前記ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ii）前記ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡが、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
（iii）前記ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
（iv）前記ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、前記検出方法。
〔３〕生体試料における、以下の［融合タンパク質群］から選択される１又は２以上の融合タンパク質に特異的に結合する抗体を含む、がんにおける融合遺伝子の検出用キット。［融合タンパク質群］
ＭＧＥＡ５－ＲＥＴ融合タンパク質
ＴＢＣ１Ｄ５－ＬＰＰ融合タンパク質
（【００１１】以降は省略されています）

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