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公開番号2024146918
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-15
出願番号2024057611
出願日2024-03-29
発明の名称改変タンパク質および糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤
出願人静岡県公立大学法人,日本食品化工株式会社
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12N 9/90 20060101AFI20241004BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】熱安定性が向上したエピメリ化反応を触媒する酵素を提供する。
【解決手段】以下の(a)から(d)のいずれかのタンパク質。(a)特定のアミノ酸配列を含むタンパク質;(b)特定のアミノ酸配列に対して90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、且つ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質;(c)特定のアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質;(d)特定のアミノ酸配列に対して70%以上のアミノ酸配列同一性を有し、且つK35R、N55S、R111A、A117P、I245V、A287P、K352R、Q377FまたはQ377Y、A385E、G387D、I391R、R423P及びD424Gから選択されるアミノ酸置換配列を含み、且つ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の(ａ)から(ｄ)のいずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１からなる群から選択される一に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１からなる群から選択される一に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９および配列番号５１からなる群から選択されるいずれか一に記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号２７に記載のアミノ酸配列においてＫ３５Ｒ、Ｎ５５Ｓ、Ｒ１１１Ａ、Ａ１１７Ｐ、Ｉ２４５Ｖ、Ａ２８７Ｐ、Ｋ３５２Ｒ、Ｑ３７７ＦまたはＱ３７７Ｙ、Ａ３８５Ｅ、Ｇ３８７Ｄ、Ｉ３９１Ｒ、Ｒ４２３ＰおよびＤ４２４Ｇからなる群から選択される一以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質に比較して熱安定性および／または高温反応性が向上している、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
【請求項４】
以下の（ｅ）から（ｈ）のいずれかのＤＮＡが導入された形質転換細胞の培養上清を含む、糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤。
（ｅ）請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２からなる群から選択される一に記載の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｇ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２からなる群から選択される一に記載の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０および配列番号５２からなる群から選択される一に記載の塩基配列に対して９０％以上の塩基配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ糖のエピメリ化反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
糖基質に、請求項１または２に記載のタンパク質、または請求項３または４に記載の酵素剤を作用させて、糖のエピメリ化反応生成物を得る工程を含む、糖のエピメリ化反応生成物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法を実施して得られた糖のエピメリ化反応生成物を用いて食品、飼料、餌料、化成品、化粧料、または医薬品を得る工程を含む、食品、飼料、餌料、化成品、化粧料、または医薬品の製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変タンパク質、当該タンパク質を含む糖のエピメリ化反応触媒用の酵素剤、および当該改変タンパク質または酵素剤を作用させて、エピメリ化反応生成物を得る工程を含む、エピメリ化反応生成物の製造方法に関する。
続きを表示（約 1,300 文字）【背景技術】
【０００２】
マンノースはグルコースの異性体であり、コンニャクなどから抽出されるグルコマンナン、ヘミセルロース、あるいは細胞表面などに存在する糖鎖の構成糖として良く知られている。また、マンノースそのものはクランベリーに含まれることが知られている。
【０００３】
マンノースの生体利用性は低く、経口摂取したマンノースのほとんどは速やかに尿中に排出される。尿路感染症の原因菌は、当該菌が有するマンノース結合レクチンと、尿路表面細胞に存在する糖鎖の結合を介して尿路表面へ付着し感染すると考えられている。経口摂取したマンノースは尿中に速やかに排出されるため、排出されたマンノースは当該菌のマンノース結合レクチンと細胞表面糖鎖への結合を阻害することで、尿路感染症を予防する効果が期待されている（非特許文献１）。
【０００４】
特許文献１にはマンノース含有糖組成物を有効成分とする有害菌感染抑制剤または有害菌感染防止用飼料に関わる技術が開示されている。特許文献２にはマンノースを有効成分とする飲食品の食感改良剤についての記述がある。
【０００５】
マンノースの調製法としては、化学反応法および酵素法が複数知られている。以下に、各調製法について検討する。
第一の化学反応法は、蔗糖を還元することでソルビトールとマンニトールを生成し、マンニトールを分取し、さらにマンニトールを酸化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は多段階のステップおよび高温高圧での触媒反応を必要とするため、効率面で問題がある。
【０００６】
第二の化学反応法は、グルコマンナンやマンナンを加水分解することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、基質が高価でありかつ基質の調製に労力を要するという問題がある。
【０００７】
第三の化学反応法は、コプラミールなどのヘミセルロースを加水分解する手法である。しかし、この方法は、構成糖が多様であるためマンノースの収率が悪く、酸加水分解の場合はさらに収率が悪化し精製負荷が大きくなるという問題がある。
【０００８】
第四の化学反応法は、グルコースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、糖の分解が生じるため収率が悪く、精製負荷が大きいという問題がある。
【０００９】
第五の化学反応法は、同じくフルクトースをアルカリ条件下で異性化することでマンノースを調製する方法である。しかし、この方法は、第四の化学反応法と同様に収率および精製負荷の点で問題があり、またフルクトースがグルコースに比べて比較的高価である点およびフルクトースが反応系に残存してしまいマンノースとの分離が困難である点も問題がある。
【００１０】
第一の酵素法としては、フルクトースにマンノースイソメラーゼを作用させることでマンノースを調製する方法である。しかし、原料となるフルクトースの価格面および反応系に残存するフルクトースの分離の点で問題がある。
（【００１１】以降は省略されています）

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