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公開番号2025083555
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-30
出願番号2025043090,2022209799
出願日2025-03-18,2017-10-05
発明の名称細胞培養液を用いて臍帯羊膜から間葉系幹細胞を単離する方法
出願人セルリサーチコーポレイションプライベートリミテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/0775 20100101AFI20250523BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】臍帯の羊膜から間葉系幹細胞集団を単離する方法、及び臍帯の羊膜から単離された間葉系幹細胞の高度に均一な集団を提供する。
【解決手段】本発明は、臍帯の羊膜から間葉系幹細胞集団を単離する方法であって、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、F12(ハムF12培地)、M171(培地171)、およびFBS(ウシ胎仔血清)を含む培養液中で臍帯組織を培養する段階を含む前記方法に関する。本発明はまた、臍帯の羊膜から単離された間葉系幹細胞集団であって、該幹細胞集団の少なくとも約90%またはそれ以上の細胞が、マーカーCD73、CD90、およびCD105の各々を発現し、かつマーカーCD34、CD45、およびHLA-DRの発現を欠いている、前記間葉系幹細胞集団に関する。本発明はまた、この間葉系幹細胞集団の薬学的組成物に関する。
【選択図】図6c
特許請求の範囲【請求項１】
臍帯の羊膜から間葉系幹細胞集団を単離する方法であって、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、F12（ハムF12培地）、M171（培地171）、およびFBS（ウシ胎仔血清）を含む培養液中で臍帯組織を培養する段階を含む、前記方法。
続きを表示（約 910 文字）【請求項２】
培養液が、最終濃度約55～65% (v/v) のDMEM、最終濃度約5～15% (v/v) のF12、最終濃度約15～30% (v/v) のM171、および最終濃度約1～8% (v/v) のFBSを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
培養液が、最終濃度約57.5～62.5% (v/v) のDMEM、最終濃度約7.5～12.5% (v/v) のF12、最終濃度約17.5～25.0% (v/v) のM171、および最終濃度約1.75～3.5% (v/v) のFBSを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
培養液が、最終濃度約61.8% (v/v) のDMEM、最終濃度約11.8% (v/v) のF12、最終濃度約23.6% (v/v) のM171、および最終濃度約2.5% (v/v) のFBSを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
培養液が、最終濃度約1 ng/ml～約20 ng/mlの上皮増殖因子 (EGF) をさらに含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培養液が、最終濃度約10 ng/mlのEGFを含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
培養液が、最終濃度約1μg/ml～10μg/mlのインスリンを含む、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培養液が、最終濃度約5μg/mlのインスリンを含む、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
培養液が、補充物質であるアデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩 (T3) のうちの少なくとも1つをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養液が、アデニン、ヒドロコルチゾン、および3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩 (T3) の3つ全てを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年10月5日に出願された米国仮特許出願第62/404,582号の優先権の恩典を主張し、その内容はすべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
続きを表示（約 2,400 文字）【０００２】
発明の分野
本発明は、臍帯の羊膜から間葉系幹細胞（またはそのような幹細胞集団）を単離する方法、および臍帯の羊膜から単離された間葉系幹細胞集団に関する。本発明はまた、臍帯の羊膜から間葉系幹細胞を単離するための細胞培養液を対象にする。本発明はまた、単離された間葉系幹細胞集団の薬学的組成物および使用を対象にする。本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞集団またはそのような間葉系幹細胞集団を含有する薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、疾患または障害を処置する方法を対象にする。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
臍帯の羊膜から単離された間葉系幹細胞は、最初に米国特許出願第2006/0078993号（特許文献1）（登録された米国特許第9,085,755号（特許文献2）および米国特許第9,737,568号（特許文献3）につながる）ならびに対応する国際特許出願WO2006/019357（特許文献4）において報告された。それ以来、臍帯組織は、多能性細胞の供給源として注目を集めている；臍帯、および具体的には臍帯の羊膜から単離された幹細胞（「臍帯ライニング (cord lining) 幹細胞」とも称される）は、広く入手可能であるため、再生医療用の細胞の優れた代替供給源と見なされている。Jeschke et al. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences; The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal, 2011, 4, 21-27（非特許文献1）を参照されたい。
【０００４】
その後の研究では、臍帯の羊膜（臍帯ライニング (CL-MSC)）、臍帯血 (CB-MSC)、胎盤 (P-MSC)、およびワルトン膠様質 (WJ-MSC) に由来するヒト間葉系幹細胞 (MSC) の表現型、増殖速度、遊走、免疫原性、および免疫調節能が比較された (Stubbendorf et al, Immunological Properties of Extraembryonic Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Gestational Tissue, STEM CELLS AND DEVELOPMENT Volume 22, Number 19, 2013, 2619-2629（非特許文献2）)。Stubbendorfらは、胚外妊娠組織に由来するMSC集団が、免疫応答を回避する、および免疫調節効果を発揮する多様な能力を示すと結論づけた。CL-MSCが低い免疫原性を示し、また増殖能および遊走能の増強を示すため、これらの細胞が細胞ベースの療法の最も有望な可能性を示すことを、著者らはまた見出した。そのため、今後の研究は、CL-MSCが投与され得る最良の疾患モデルに焦点を合わせるべきである。
【０００５】
羊膜の間葉系幹細胞は、米国特許出願第2006/0078993号（特許文献1）および国際特許出願WO2006/019357（特許文献4）に記載されたプロトコールを用いて容易に得ることができるが、高度に均一でありしたがって臨床試験に使用され得る、これらの臍帯ライニングMSCの集団を単離できるようにする方法が手元にあることは、これらの臍帯ライニングMSCを用いる臨床試験のために有利である。
【０００６】
よって、本発明の目的は、この要求を満たす、臍帯の羊膜に由来する間葉系幹細胞の集団を単離する方法を提供することである。したがって、臍帯の羊膜から単離された間葉系幹細胞の高度に均一な集団を提供することもまた、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
米国特許出願第2006/0078993号
米国特許第9,085,755号
米国特許第9,737,568号
国際特許出願WO2006/019357
【非特許文献】
【０００８】
Jeschke et al. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences; The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal, 2011, 4, 21-27
Stubbendorf et al, Immunological Properties of Extraembryonic Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Gestational Tissue, STEM CELLS AND DEVELOPMENT Volume 22, Number 19, 2013, 2619-2629
【発明の概要】
【０００９】
この目的は、独立請求項の特徴を有する方法、間葉系幹細胞集団、各薬学的組成物、および細胞培養液によって達成される。
【００１０】
第1局面において、本発明は、臍帯の羊膜から間葉系幹細胞集団を単離する方法を提供し、該方法はDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、F12（ハムF12培地）、M171（培地171）、およびFBS（ウシ胎仔血清）を含む培養液中で臍帯組織を培養する段階を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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