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公開番号2025081574
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-27
出願番号2025026375,2021568012
出願日2025-02-21,2020-05-15
発明の名称メッセンジャーRNAの精製方法
出願人トランスレイトバイオ, インコーポレイテッド
代理人個人,個人
主分類C12N 15/10 20060101AFI20250520BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】いかなる苛性または可燃性の溶媒も使用することなく、臨床使用に適した高品質のメッセンジャーRNA(mRNA)を精製するための方法を提供する。
【解決手段】メッセンジャーRNA(mRNA)を精製する方法であって、a)高モル塩溶液および両親媒性ポリマーを含む懸濁液中で前記mRNAを沈殿させて、沈殿したmRNAを提供することと、b)前記沈殿したmRNAを捕捉することと、c)工程b)で捕捉された前記沈殿したmRNAを、洗浄溶液で洗浄して、前記沈殿したmRNAを精製することと、d)工程c)からの前記沈殿したmRNAを可溶化して、精製されたmRNA組成物を得ることと、を含む、方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、
ａ）高モル塩溶液および両親媒性ポリマーを含む懸濁液中で前記ｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを提供することと、
ｂ）前記沈殿したｍＲＮＡを捕捉することと、
ｃ）工程ｂ）で捕捉された前記沈殿したｍＲＮＡを、洗浄溶液で洗浄して、前記沈殿したｍＲＮＡを精製することと、
ｄ）工程ｃ）からの前記沈殿したｍＲＮＡを可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法。
続きを表示（約 690 文字）【請求項２】
前記精製されたｍＲＮＡ組成物が、短鎖不全型（ｓｈｏｒｔａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、長鎖不全型（ｌｏｎｇａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒、および／または残留塩を含む混入物を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記残留プラスミドＤＮＡが、１０ｐｇ／ｍｇ以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記両親媒性ポリマーが、プルロニクス、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記両親媒性ポリマーがＰＥＧである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記懸濁液が、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度のＰＥＧを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁液が、約５０重量／体積％の濃度のＰＥＧを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記高モル塩溶液が、チオシアン酸グアニジニウム（ＧＳＣＮ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
両親媒性ポリマーを含む洗浄溶液が、工程ｃ）で前記ｍＲＮＡを洗浄するために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記両親媒性ポリマーがＰＥＧを含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／８４８，４１２号および２０１９年８月２６日に出願された同第６２／８９１，７８１号に対する優先権を主張するものであり、これらのそれぞれは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,600 文字）【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）療法は、様々な疾患の治療にとってますます重要なアプローチとなりつつある。ｍＲＮＡ療法は、治療を必要とする患者へのインビトロ転写した（ＩＶＴ）および高純度のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む医薬品の投与、および患者の体内のｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生が含まれる。したがって、治療用途に適した高純度のｍＲＮＡ産物の効率的で大規模な生産に対するニーズがある。
【０００３】
従来、インビトロ転写から産生されたｍＲＮＡは、市販のクロマトグラフィーシステム、例えばＨＰＬＣを用いて、および／または有機混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）への抽出およびその後のエタノール沈殿によって精製される。しかしながら、カラムシステムの使用は高価かつ困難であり、ｍＲＮＡの抽出における苛性溶媒または可燃性溶媒の使用は、特に大規模な用途において、安全性およびコスト上の課題を呈することがある。
【０００４】
治療用途に許容可能な高純度のｍＲＮＡを産生する、安全で費用効果の高い方法は、現在のところない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、とりわけ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する非常に効率的で費用効果の高い方法を提供する。本発明は、部分的に、少量の揮発性有機化合物を使用してまたは揮発性有機化合物を使用せずにｍＲＮＡを精製する方法の驚くべき発見に基づいており、高完全性および高純度のｍＲＮＡをもたらす。したがって、一態様では、本発明は、いかなる苛性または可燃性の溶媒も使用することなく、大規模な製造プロセスの治療用途に使用することができるｍＲＮＡを精製するより効果的で、信頼性があり、かつ安全な方法を提供する。
【０００６】
一部の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、ａ）高モル塩溶液および両親媒性ポリマーを含む懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを提供することと、ｂ）沈殿したｍＲＮＡを捕捉することと、ｃ）工程ｂ）で捕捉された沈殿したｍＲＮＡを洗浄溶液で洗浄して、沈殿したｍＲＮＡを精製することと、ｄ）工程ｃ）からの沈殿したｍＲＮＡを可溶化溶液で可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、短鎖不全型（ｓｈｏｒｔａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、長鎖不全型（ｌｏｎｇａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む混入物が実質的に存在しない。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、短鎖不全型ＲＮＡ種を含む混入物を実質的に含まない。例えば
、精製されたｍＲＮＡ組成物は、約１％未満の短鎖不全型ＲＮＡ種を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、長鎖不全型ＲＮＡ種を含む混入物が実質的に存在しない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって決定される場合、約５５％以下の長鎖不全型／分解種を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、１％未満の二本鎖ＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、残留プラスミドＤＮＡを含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、１０ｐｇ／ｍｇ以下の残留プラスミドＤＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製ｍＲＮＡ組成物は、残留インビトロ転写酵素を含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物１５μｇに対して、０．３ｎｇ未満のポリメラーゼである。精製されたｍＲＮＡ組成１５μｇに対して、０．３ｎｇ未満のキャップ酵素である。精製されたｍＲＮＡ組成物１５μｇに対して、０．３ｎｇ未満のテール酵素である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、残留溶媒を含む混入物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、残留塩を含む混入物を実質的に含まない。
【０００８】
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１０ｐｇ／ｍｇ精製ｍＲＮＡ以下の残留プラスミドＤＮＡを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエーテル、例えばポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）もしくはポリプロピレンオキシド、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、プルロニックである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドンである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリビニルアルコールである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリエーテルである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）である。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリプロピレンオキシドである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、懸濁液は有機溶媒を含まない。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、懸濁液は有機溶媒を含まず、ｍＲＮＡはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して沈殿させる。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ｍＲＮＡを沈殿させるためのＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度でＰＥＧを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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