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公開番号2025015430
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-30
出願番号2024089307
出願日2024-05-31
発明の名称ポルフィリン含有ポリアミンが固定化された基材を含む複合体、複合体を含む細胞培養基材、それらの製造方法、細胞を刺激する方法、及び、抗原提示細胞の製造方法
出願人国立研究開発法人物質・材料研究機構
代理人
主分類C08F 8/00 20060101AFI20250123BHJP(有機高分子化合物;その製造または化学的加工;それに基づく組成物)
要約【課題】細胞培養を可能にする複合体、及び、光の照射により細胞培養をしながら細胞に酸化ストレス障害を与えることができる細胞培養基材、これらの製造方法、及び、細胞を刺激する方法を提供すること。
【解決手段】本発明の複合体は、基材と、それに固定化された以下の式(I)で示される繰り返し単位と式(II)で示される繰り返し単位と式(III)で示される繰り返し単位とを含む共重合体とを含む。
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【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
基材と、
前記基材に固定化された以下の式（Ｉ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩＩ）で示される繰り返し単位とを含む共重合体とを含む、複合体。
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2025015430000015.jpg
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156
（式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）中、
Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
Ｌ
１
は、Ｏ又はＮＨであり、
Ｌ
２
は、２価の基であり、
Ｘは、ハロゲン原子であり、
Ｙは、シランカップリング剤を介して前記基材に結合する結合様式を示し、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ
２
－＊、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－Ｒ
２
－＊、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ
２
－＊、及び、－Ｃ（－ＯＨ）－Ｒ
２
－＊からなる群から少なくとも１つ選択され、＊は前記基材との結合位置を表し、Ｒ
２
は、炭素数１～５の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、及び、炭素数７～１０のアラルキル基からなる群から選択され、
Ｚは、ポルフィリン誘導体又はその塩から任意の水素原子を１個除いた基である。）
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
前記Ｌ
２
は、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の環状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の芳香族炭化水素基、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ
３
）－（式中、Ｒ
３
は、水素原子、又は、炭素数１～１２の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）
２
－、－Ｓ（＝Ｏ）
２
－Ｏ－、－ＣＨ＝Ｎ－、及び、これらを組み合わせた基からなる群から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記共重合体の全繰り返し単位数に対する、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、１～５０％であり、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、１～５０％である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ポルフィリン誘導体が、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン、ヘプタカルボキシポルフィリン、ヘキサカルボキシポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン、及び、これらのポルフィリンの塩からなる群から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
Ｌ
２
は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表す、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
Ｒ
１
は、－ＣＨ
３
を表し、
Ｌ
１
は、－ＮＨ－を表し、
Ｌ
２
は、－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－を表し、
Ｚは、ヘマトポルフィリン二塩酸塩である、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記共重合体の分子量（Ｍｗ）は、３００～１０００００００である、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記基材がガラス基板である、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記ガラス基板の厚さは、０．０４ｍｍ～０．６０ｍｍであり、
波長３００ｎｍ～１０００ｎｍの光の透過率が８０％以上である、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
式（ＩＡ）で表されるモノマーを重合させ、第一級アミノ基を有するポリアミンを合成することと、
前記基材にシランカップリング剤を修飾させることと、
前記基材に前記ポリアミンを修飾させることと、
前記ポリアミンにポルフィリン誘導体又はその塩を反応させたポルフィリン含有ポリアミンを生成することと
を包含する、請求項１～９のいずれかに記載の複合体の製造方法。
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2025015430000016.jpg
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75
（式（ＩＡ）中、
Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、
Ｌ
１
は、Ｏ又はＮＨであり、
Ｌ
２
は、２価の基であり、
Ｘは、ハロゲン原子である。）
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポルフィリン含有ポリアミンが固定化された基材を含む複合体、複合体を含む細胞培養基材、それらの製造方法、細胞を刺激する方法、及び、抗原提示細胞の製造方法に関する。
続きを表示（約 5,700 文字）【背景技術】
【０００２】
生物は、呼吸により酸素を取りこみ、エネルギーを産生している。その一部の酸素は、生物内で、スーパーオキシドラジカルやヒドロキシラジカル、過酸化水素、アルコキシラジカル等の反応性の高い活性酸素種となる。生体の中には、ビタミンＥなどの抗酸化剤やスーパーオキシドペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の抗酸化酵素があるため、通常、発生した活性酸素は速やかに消去されるものの、過剰に発生した活性酸素は、抗酸化剤等では消去することができず、細胞内に拡散し、細胞内の核酸、たんぱく質、脂質等、さまざまな細胞成分を酸化し、ダメージを与える。これを、酸化ストレスと呼ぶ。酸化ストレスは、老化、感染症、がん、心筋梗塞、動脈硬化症、腎機能障害、認知症、パーキンソン病、自閉症、うつ病など様々な疾患に関与していることが知られている。
【０００３】
近年、これらの活性酸素種の中でも、脂質ラジカルやその代謝産物が様々な疾患や炎症の原因分子として作用することが報告されている。例えば、鉄依存性細胞死（フォロトーシス）などに細胞内の脂質ラジカルや酸化脂質が関与していることが報告され、脂質ラジカルや酸化脂質に関する研究が盛んにおこなわれている。よって、細胞内の脂質ラジカルを選択的に発生させる方法に対するニーズが存在する。
【０００４】
従来の酸化ストレスに関する研究手法として、過酸化水素を細胞培養液に添加し、細胞内酸化ストレスを惹起する方法がある（例えば、非特許文献１を参照）。しかし、過酸化水素は、細胞膜透過性を有しており、細胞の中の様々な成分を酸化するため、細胞内で脂質ラジカルを選択的に発生させることはできない。一方、脂質ラジカルに関する研究手法として、酸化反応開始剤２，２’－ａｚｏｂｉｓ（２－ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，２，２’－ａｚｏｂｉｓ（４－ｍｅｔｈｏｘｙ－２，４－ｄｉｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）などを細胞培養液に添加する手法が用いられている（例えば、非特許文献２を参照）。しかし、これらの酸化剤を細胞培養液中に添加すると、細胞内に拡散し、脂質ラジカルのみを発生させるだけでなく、細胞質や核内でも様々な活性酸素種を発生する。よって、脂質ラジカルのみを細胞内で発生させる手法はこれまでなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
五十嵐和彦、土肥由裕、“細胞老化の酸化ストレス応答性：Ｂａｃｈ１による指揮”、生化学第８１巻第６号（２００９）：５０２－５１０
松岡悠太、”生体内酸化還元物質を高感度かつ選択的に検出する蛍光プローブの開発と応用”、ＹＡＫＵＧＡＫＵＺＡＳＳＨＩ１４１（２０２１）：１２９７－１３０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上から、本発明の課題の１つは、細胞培養を可能にする複合体（例えば、特定の共重合体が固定化されたガラス基板）、及び、光の照射により細胞培養をしながら細胞に酸化ストレス障害を与えることができる細胞培養基材（例えば、細胞培養皿）、これらの製造方法、細胞を刺激する方法を提供することである。本発明のさらなる課題の１つは、選択的に細胞内で脂質ラジカル産生を引き起こし、細胞質内で過剰な活性酸素種を産生しない、複合体、細胞培養基材、これらの製造方法、及び、細胞を刺激する方法を提供することである。また、本発明の別の課題の１つは、抗炎症性サイトカインの産生能を有する抗原提示細胞の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、第一級アミノ基を有するポリアミンを有する構成単位と、ポルフィリン誘導体又はその塩を有する構成単位とを含む共重合体が固定化された基材（例えば、ガラス基板）は、細胞が静電的に基材表面に安定して接着して培養することができ、ポルフィリンを励起することが可能な光を照射することにより、選択的に脂質ラジカル産生を引き起こし、細胞質内で過剰な活性酸素種を産生しないことを見出し、本発明をなすに至った。
【０００８】
本発明の複合体は、基材と、前記基材に固定化された以下の式（Ｉ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩ）で示される繰り返し単位と式（ＩＩＩ）で示される繰り返し単位とを含む共重合体とを含み、これにより上記課題を解決する。
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156
（式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）中、Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、Ｌ
１
は、Ｏ又はＮＨであり、Ｌ
２
は、２価の基であり、Ｘは、ハロゲン原子であり、Ｙは、シランカップリング剤を介して前記基材に結合する結合様式を示し、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ
２
－＊、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－Ｒ
２
－＊、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ
２
－＊、及び、－Ｃ（－ＯＨ）－Ｒ
２
－＊からなる群から少なくとも１つ選択され、＊は前記基材との結合位置を表し、Ｒ
２
は、炭素数１～５の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、及び、炭素数７～１０のアラルキル基からなる群から選択され、Ｚは、ポルフィリン誘導体又はその塩から任意の水素原子を１個除いた基である。）
前記Ｌ
２
は、炭素数１～５の二価の直鎖状脂肪族炭化水素基、炭素数３～５の二価の分岐状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の環状脂肪族炭化水素基、炭素数５～１０の二価の芳香族炭化水素基、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ
３
）－（式中、Ｒ
３
は、水素原子、又は、炭素数１～１２の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表す）、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ（＝Ｏ）
２
－、－Ｓ（＝Ｏ）
２
－Ｏ－、－ＣＨ＝Ｎ－、及び、これらを組み合わせた基からなる群から選択されてもよい。
前記共重合体の全繰り返し単位数に対する、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、１～５０％であり、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位数の割合が、１～５０％であってもよい。
前記ポルフィリン誘導体が、メソポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン、サイトポルフィリン、ロドポルフィリン、ピロポルフィリン、フィロポルフィリン、ヘプタカルボキシポルフィリン、ヘキサカルボキシポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン、及び、これらのポルフィリンの塩からなる群から選択されてもよい。
Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、Ｌ
２
は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキレンを表してもよい。
Ｒ
１
は、－ＣＨ
３
を表し、Ｌ
１
は、－ＮＨ－を表し、Ｌ
２
は、－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－を表し、Ｚは、ヘマトポルフィリン二塩酸塩であってもよい。
前記共重合体の分子量（Ｍｗ）は、３００～１０００００００であってもよい。
前記基材は、ガラス基板であってもよい。
前記ガラス基板の厚さは、０．０４ｍｍ～０．６０ｍｍであり、波長３００ｎｍ～１０００ｎｍの光の透過率が８０％以上であってもよい。
本発明の上記複合体の製造方法は、式（ＩＡ）で表されるモノマーを重合させ、第一級アミノ基を有するポリアミンを合成することと、前記基材にシランカップリング剤を修飾させることと、前記基材に前記ポリアミンを修飾させることと、前記ポリアミンにポルフィリン誘導体又はその塩を反応させたポルフィリン含有ポリアミンを生成することとを包含し、これにより上記課題を解決する。
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118
75
（式（ＩＡ）中、Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、Ｌ
１
は、Ｏ又はＮＨであり、Ｌ
２
は、２価の基であり、Ｘは、ハロゲン原子である。）
本発明による上記複合体の製造方法は、式（ＩＡ）で表されるモノマーを重合させ、第一級アミノ基を有するポリアミンを合成することと、前記ポリアミンにポルフィリン誘導体又はその塩を反応させたポルフィリン含有ポリアミンを生成することと、前記基材にシランカップリング剤を修飾させることと、前記基材に前記ポルフィリン含有ポリアミンを修飾させることとを包含し、これにより上記課題を解決する。
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2025015430000004.jpg
118
75
（式（ＩＡ）中、Ｒ
１
は、水素原子、又は、炭素数１～５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を表し、Ｌ
１
は、Ｏ又はＮＨであり、Ｌ
２
は、２価の基であり、Ｘは、ハロゲン原子である。）
本発明の細胞培養基材は、本発明の上記複合体を含む。
本発明の細胞培養基材は、細胞培養皿であってもよい。
本発明による細胞培養皿は、容器と、前記容器に貼り付けられた本発明の上記複合体とを含み、これにより上記課題を解決する。
波長３００ｎｍ～６５０ｎｍの光を照射することにより、前記ポルフィリン誘導体又はその塩に含まれるポルフィリンが励起され、一重項酸素を発生してもよい。
本発明による細胞培養皿の製造方法は、式（ＩＡ）で表されるモノマーを重合させ、第一級アミノ基を有するポリアミンを合成することと、ガラス基板にシランカップリング剤を修飾させることと、前記ガラス基板を容器に貼り付けることと、前記ガラス基板に前記ポリアミンを修飾させることと、前記ポリアミンにポルフィリン誘導体又はその塩を反応させたポルフィリン含有ポリアミンを生成することとを包含し、これにより上記課題を解決する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の基材（例えば、ガラス基板）上に固定化された共重合体のうち、正電荷を有している部分は、負電荷を有する細胞の接着を促進する特性を有する。また基材上に固定化された共重合体のうち、ポルフィリンを有している部分は、光照射により一重項酸素を発生する特性を有する。複合体（例えば、共重合体固定化ガラス基板）上で細胞を培養しながら光照射を行うと、複合体表面近傍から一重項酸素が発生し、細胞を刺激すること（例えば、酸化ストレス障害を与えること）ができる。光照射条件により一重項酸素発生量はコントロールすることができ、強い光を照射すると、細胞全体が酸化ストレスを受けるが、適切な強度の光照射することにより、細胞内で過剰に活性酸素種が存在せず、複合体上に接着している細胞内の脂質のみを選択的に酸化し、脂質ラジカルを発生させることができる。このように、本発明の共重合体が固定化された基材（即ち、複合体）及び細胞培養基材（例えば、細胞培養皿）は、光照射条件を制御することにより、細胞の酸化ストレス状態を制御することが可能な実験手法を提供することができる。また、本発明の抗原提示細胞の製造方法では、一重項酸素を発生する細胞培養基材を用いることで、未成熟樹状細胞を刺激して成熟を促し、抗炎症性サイトカインを産生させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明の複合体（ポルフィリン含有ポリアミンが固定化されたガラス基板）を示す模式図
本発明の細胞培養基材（細胞培養皿）を示す模式図
細胞培養皿を用いた細胞を刺激する（酸化する）工程を示すフローチャート
ポリＮ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミドのクロマトグラムを示す図
ポリＮ－（３－アミノプロピル）メタクリルアミドの
１
ＨＮＭＲスペクトルを示す図
実施例１の細胞培養皿を製造するプロシージャを示す図
実施例１、比較例１及び比較例２の細胞培養皿を用いた細胞生存及び細胞膜透過性試験の結果を示す図
実施例１及び比較例３の細胞培養皿を用いた一重項酸素の発生の結果を示す図
実施例１及び比較例３の細胞培養皿におけるレーザー照射による温度上昇の測定の結果を示す図
実施例１の細胞培養皿を用いたレーザー照射による細胞内活性酸素の検出の結果を示す図
実施例１の細胞培養皿を用いたレーザー照射による細胞内酸化脂質の検出の結果を示す図
実施例１及び比較例３の細胞培養皿を用いて培養した樹状細胞の蛍光顕微鏡写真
実施例１及び比較例３の細胞培養皿を用いて培養した樹状細胞に卵白アルブミンＯＶＡ２５７－２６４ペプチドを添加した際の抗原提示量
実施例１及び比較例３の細胞培養皿を用いて培養した樹状細胞に卵白アルブミンＯＶＡ２５７－２６４ペプチドを添加した際のサイトカイン産生量
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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