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公開番号2025011237
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-23
出願番号2024178873,2022110620
出願日2024-10-11,2017-04-20
発明の名称DPP3の定量方法および治療方法
出願人4ティーン4 ファーマシューティカルズゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/37 20060101AFI20250116BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法を提供する。
【解決手段】体液試料中の活性DPP3を定量する。
【選択図】図2A
特許請求の範囲【請求項１】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法であって、
前記被験者の体液試料中のＤＰＰ３総量を定量し、かつ／または活性ＤＰＰ３の量を定量することと、
定量された前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量を所定の閾値と比較することとを含み、
定量された前記量が前記所定の閾値を超える場合、前記被験者は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する疾患または状態を有すると診断される、方法。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量は濃度の単位で定量される、請求項１に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項３】
前記試料は全血、血清、血漿を含む群から選択される、請求項１または２に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項４】
前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項５】
前記ＤＰＰ３総量および／または活性ＤＰＰ３の量は前記被験者の体液試料中で定量され、かつ
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項６】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項５に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項７】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項５または６に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項８】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項５～７のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項９】
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、請求項５～８のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１０】
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ－Ａｒｇ－βＮＡ、Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、請求項５～９のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法、体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法、および前記疾患を治療する方法に関する。
続きを表示（約 2,400 文字）【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼ３（ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルアリールアミダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、エンケファリナーゼＢまたは赤血球アンギオテンシナーゼとしても知られており、省略名はＤＰＰ３、ＤＰＰＩＩＩ）は、エンケファリンやアンギオテンシンなどの生理活性ペプチドからジペプチドを除去するメタロペプチダーゼである。
【０００３】
ＤＰＰ３は１９６７年にEllisとNuenkeにより、精製ウシ脳下垂体前葉抽出物で最初に同定され、その活性が測定された。ＥＣ３．４．１４．４として登録されているこの酵素は約８３ｋＤａの分子量を有し、原核生物および真核生物で高度に保存されている（Prajapati & Chauhan 2011）。そのヒト変異体のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩは遍在的に発現される主に細胞質のペプチダーゼである。シグナル配列が存在しないにもかかわらず、膜での活性がいくつかの研究で報告されている（Lee & Snyder 1982）。
【０００４】
ＤＰＰ３はＭ４９ペプチダーゼファミリーに属する亜鉛依存性エキソペプチダーゼであり、様々な組成の３、４個～１０個のアミノ酸のオリゴペプチドに対して広い基質特異性を有し、プロリンの後を切断することもできる。ＤＰＰ３は、その基質（アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ；ＬｅｕエンケファリンおよびＭｅｔエンケファリン；エンドモルフィン１および２など）のＮ末端からジペプチドを加水分解することが知られている。メタロペプチダーゼであるＤＰＰ３はｐＨ８．０～９．０で最適な活性を有し、Ｃｏ
２＋
およびＭｇ
２＋
のような二価の金属イオンの添加によって活性化できる。ＤＰＰ３の構造解析により、基質結合および加水分解に重要な以下のアミノ酸Ｇｌｕ３１６、Ｔｙｒ３１８、Ａｓｐ３６６、Ａｓｎ３９１、Ａｓｎ３９４、Ｈｉｓ５６８、Ａｒｇ５７２、Ａｒｇ５７７、Ｌｙｓ６６６、およびＡｒｇ６６９と共に触媒モチーフＨＥＬＬＧＨ（ｈＤＰＰ３、４５０～４５５）およびＥＥＣＲＡＥ（ｈＤＰＰ３、５０７～５１２）が明らかになった（Prajapati & Chauhan 2011およびKumar et al. 2016；番号はヒトＤＰＰ３の配列を示す（配列番号１を参照のこと））。基質結合および加水分解に関与するすべての既知のアミノ酸または配列領域を考慮すると、ヒトＤＰＰ３の活性部位は、アミノ酸３１６～６６９の間の領域と定義できる。
【０００５】
ＤＰＰ３の活性は、様々な一般的なプロテアーゼ阻害剤（たとえば、ＰＭＳＦ、ＴＰＣＫ）、スルフヒドリル試薬（たとえば、ｐＨＭＢ、ＤＴＮＢ）、および金属キレート剤（ＥＤＴＡ、ｏ－フェナントロリン）で非特異的に阻害できる（Abramic et al. 2000）。
【０００６】
ＤＰＰ３活性は様々な種類の化合物で特異的に阻害できる：内在性ＤＰＰ３阻害物質はスピノルフィンというペプチドである。数種の合成スピノルフィン誘導体（たとえばチノルフィン）が生成されており、様々な程度でＤＰＰ３活性を阻害することが示されている（Yamamoto et al. 2000）。公開されている他のＤＰＰ３のペプチド阻害剤はプロピオキサチンＡおよびＢ（US4804676）、ならびにプロピオキサチンＡ類似体（Inaoka et al. 1988）である。
【０００７】
ＤＰＰ３は、フルオスタチン類およびベンズイミダゾール誘導体などの小分子によっても阻害できる。フルオスタチンＡおよびＢはストレプトミセス属の種（Streptomyces sp.）ＴＡ－３３９１で産生される抗生物質で、毒性はなく、ＤＰＰ３活性を強く阻害する。これまでに２０種の様々なベンズイミダゾール誘導体が合成され公開されている（Agic et al. 2007；Rastija et al. 2015）が、そのうち２種類の化合物１’および４’が最も強い阻害効果を示す（Agic et al. 2007）。ＤＰＰ３阻害剤の完全な一覧については表２を参照のこと。
【０００８】
細胞生理学におけるＤＰＰ３の正確な生物学的機能はわかっていないが、最近の知見は、タンパク質代謝だけでなく血圧制御、疼痛調節および炎症過程でも役割を果たすと示している（Prajapati & Chauhan 2011）。
【０００９】
ＤＰＰ３はいくつかの文献（いずれも細胞内ＤＰＰ３について記載）で有望なバイオマーカーであることが示されている。卵巣および子宮内膜腫瘍のホモジネートでＤＰＰ３活性が上昇することが示されている。ＤＰＰ３活性は、これらの腫瘍の重症度／悪性度とともにさらに増加する（Simaga et al. 1998, 2003）。膠芽腫細胞株の免疫組織学検査およびウエスタンブロット分析もＤＰＰ３レベルの上昇を示した（Singh et al. 2014）。
【００１０】
細胞内または膜ＤＰＰ３は、有望な動脈リスクマーカー（US2011008805）およびリウマチ様関節症のマーカーであることも提唱されている（US2006177886）。特許出願WO2005106486は、細胞表面または細胞表面内にＤＰＰ３が遍在的に発現することから、ＤＰＰ３の発現やあらゆる種類の疾患の診断マーカーとしての活性、ならびに治療剤としてのＤＰＰ３について記載している。EP1498480は、ＤＰＰ３を含む加水分解酵素の潜在的な診断・治療用途について記載している。
（【００１１】以降は省略されています）

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