特許ウォッチ

公開番号2024170576
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-12-10
出願番号2024154205,2022139343
出願日2024-09-06,2018-02-16
発明の名称BCMA関連癌および自己免疫疾患の治療のための併用療法
出願人フレッドハッチンソンキャンサーセンター
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類A61K 38/16 20060101AFI20241203BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】BCMA関連癌および自己免疫疾患の治療のための併用療法の提供。
【解決手段】本発明は、BCMA特異的結合分子(例えばBCMA特異的キメラ抗原受容体または抗体)をγ-セクレターゼ阻害剤と併用する方法であって、B細胞関連増殖性疾患、例えば癌または自己免疫疾患等を治療または予防するために同時にまたは連続的に実施することができる方法に関する。γ-セクレターゼ阻害剤と併用されるBCMA特異的結合分子は、例えば養子免疫療法において利用することができる。
【選択図】図7B
特許請求の範囲【請求項１】
BCMA発現に関連した疾患もしくは障害を有するかまたは有する疑いのある対象において、
(i)癌などの増殖性疾患もしくは障害、および／または
(ii)自己免疫疾患もしくは障害
を治療する方法であって、治療有効量のBCMA特異的結合タンパク質と治療有効量のγ－セクレターゼ阻害剤とを前記対象に投与することを含む、方法。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
前記BCMA特異的結合タンパク質が、BCMA特異的抗体もしくはその抗原結合部分、キメラ抗原受容体（CAR）またはタグ付キメラ抗原受容体分子（T-ChARM）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記BCMA特異的結合タンパク質が、ヒトであるかまたはヒト化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記BCMA特異的タンパク質が、BCMA特異的scFv、BCMA特異的scTCR、もしくはBCMAリガンドまたはそれらの結合性部分を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記BCMA特異的結合タンパク質が、BCMA抗体J22.0-xi、J22.9-xi、J6M0、J6M1、J6M2、J9M0、J9M1、J9M2、11D5-3、CA8、A7D12.2、C11 D5.3、C12A3.2、C13F12.1、13C2、17A5、83A10、13A4、13D2、14B11、14E1、29B11、29F3、13A7、CA7、S307118G03、SG1、S332121F02、S332126E04、S322110D07、S336105A07、S335115G01、S335122F05、ET140-3、ET140-24、ET140-37、ET140-40、ET140-54、TBL-CLN1、C4.E2.1、Vicky-1、pSCHLI333、pSCHLI372、またはpSCHLI373に基づいた重鎖および軽鎖可変領域を含むscFvである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記BCMA特異的結合タンパク質が、細胞外成分と細胞内成分との間に置かれた疎水性部分を含むキメラ抗原受容体であり、ここで前記細胞外成分がBCMA特異的結合タンパク質を含み、前記BCMA特異的結合タンパク質が(a) BCMA抗体 J22.0-xi、J22.9-xi、J6M0、11D5-3、CA8、A7D12.2、C11 D5.3、C12A3.2、C13F12.1、13C2、17A5、83A10、13A4、13D2、14B11、14E1、29B11、29F3、13A7、CA7、SG1、S307118G03、S332121F02、S332126E04、S322110D07、S336105A07、S335115G01、S335122F05、ET140-3、ET140-24、ET140-37、ET140-40、ET140-54、TBL-CLN1、C4.E2.1、Vicky-1、pSCHLI333、pSCHLI372もしくはpSCHLI373由来のBCMA特異的抗原結合部分；あるいは(b) BAFFもしくはAPRLILに基づくまたは由来するBCMAリガンドもしくはその結合性部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記疎水性部分が膜貫通ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記膜貫通ドメインがCD4、CD8、CD28またはCD27膜貫通ドメインである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞内成分がエフェクタードメインもしくはその機能性部分、共刺激ドメインもしくはその機能性部分、またはその任意組み合わせを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞内成分が、4-1BB (CD137)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、OX40 (CD134)、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2、もしくはそれらの機能性部分、またはそれらの任意組み合わせを含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
〔政府支援の陳述〕
本発明は、国立衛生研究所（the National Institutes of Health）により授与されたCA136551の下に政府支援を受けて行われた。
続きを表示（約 14,000 文字）【０００２】
〔配列表に関する陳述〕
本願明細書に添付される配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書中に参考として組み込まれる。配列表を含むテキストファイル名は360056_445WO_SEQUENCE_LISTING.txtである。テキストファイルは14.4 KBであり、2018年２月16日に作成され、EFS-Web経由で今ここに電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫系は一般に外来物質と病原体の侵入から身体を保護する。Ｂ細胞とも呼ばれ免疫系の一成分であるＢリンパ球は、外来物質や病原体に結合する抗体、ある場合にはその破壊を媒介する抗体を産生する。しかしながら、場合によっては、免疫系が調節異常となり、Ｂ細胞の無制御増幅を伴う疾患、例えば癌、自己免疫疾患および炎症疾患を引き起こす。
【０００４】
成熟Ｂ細胞とそれらの分化した子孫は、その細胞表面上の分子、例えばＢ細胞成熟抗原（BCMA；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17（TNFRSF17）、TNFRSF13AおよびCD269としても知られる）により同定することができ、そのような分子は形質細胞とある種の成熟Ｂ細胞上に発現される。BCMAは、Ｂ細胞活性化因子（BAFF；TNFSF13B、TALL-1およびCD257としても知られる）および増殖誘導性リガンド（APRIL；TNFSF13、TALL-2およびCD256としても知られる）に特異的に結合し、NF-κB活性化を導き得ることが知られている。BCMA特異的キメラ抗原受容体（CAR）で改変されたＴ細胞の養子免疫導入、裸のBCMA特異抗体、または治療成分に複合化されたBCMA特異抗体（放射能標識などの抗体医薬複合体(ADC））の投与をはじめとする、BCMAターゲット療法を用いて、多発性骨髄腫のような或るタイプのＢ細胞悪性を治療することができるが、腫瘍細胞表面上に発現されるBCMA分子の数および／または血液循環中の可溶性BCMAの存在により、その効能は限定的でありうる。癌細胞上の低度のBCMA表面発現または可溶性BCMAの存在は、腫瘍細胞の表面上に存在するBCMAへの不適当な結合のために治療薬の効能を制限し阻害してしまう。抗体、抗体医薬複合体（コンジュゲート）、またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞により標的指向される腫瘍細胞上の別の標的分子（例えばCD19、CD20）の濃度が低いことは、それらの療法の効能を制限することが証明されており、その結果、低レベルの標的分子を発現する癌細胞は排除を免れることができてしまう。BCMAの場合、該分子の短い細胞外部分が、タンパク質開裂に関与する膜限局化細胞性酵素であるガンマ－セクレターゼ（γ－セクレターゼ）の作用を通して、細胞表面から切除され脱落する。この開裂は、該分子を発現する骨髄腫細胞のような細胞上のBCMA密度を低下させ、ある種の自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス）や癌（例えば多発性骨髄腫）を有する患者の血清中の可溶性BCMA（sBCMA）のレベルの上昇を引き起こす。
【０００５】
現在、自己免疫疾患と癌をより効率的に治療するための代替的なまたは改善された組成物と方法が免疫療法分野において必要とされ続けている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、自己免疫疾患および癌を治療するための組成物および方法であって、可溶性形態であるかまたは細胞傷害性細胞上もしくは他の細胞上に発現されたＢ細胞成熟抗原（BCMA）特異的結合タンパク質とγ-セクレターゼ阻害剤（GSI）との併用を通した前記組成物および方法を提供する。そのようなBCMA特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、例えば養子免疫療法で使用するための改変された宿主免疫細胞（例えばＴ細胞）を創製することができる。特定の態様において、本開示は、GSIとの併用治療を必要とする対象におけるそのような治療の使用に向けられ、後者の治療は養子免疫療法（すなわち細胞表面上にBCMA特異的結合タンパク質を発現する改変免疫細胞を用いた免疫療法）の前、同時、または後に施すことができる。抗体またはその抗原結合部分を含むBCMA特異的結合タンパク質と組み合わせてGSIを投与することを含む免疫療法も提供し、ここで前記BCMA特異的結合タンパク質は、その特定の実施形態では、細胞傷害性薬に複合化または他の形で結合することができ、例えば抗体－薬物複合体（ADC）を形成することができる。有用な治療用途には、BCMA陽性細胞が病因であるような対象における増殖性疾患もしくは障害（癌など）、自己免疫疾患、または老化に関連した疾患もしくは障害の治療が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１Ａ～１Ｐは、本開示の典型的なキメラ抗原受容体（CAR）分子の設計と機能性試験を示す。（Ａ）A7D12.2抗体（「A7」）またはC11D5.3抗体（「C11」）に由来するBCMA特異的scFv、スペーサー領域（IgG4ヒンジ領域からなる）および疎水性部分（CD28膜貫通ドメインからなる）からなる細胞外成分と、CD3ζエフェクタードメインと4-lBB共刺激ドメインからなる細胞内成分とを有する代表的なCARの図。scFvは、Ｖ
H
領域のＣ末端がＶ
L
領域のＮ末端に連結されて（「ＨＬ」の配向で）（「Ｇ
4
Ｓ」可変領域リンカー（配列番号30）を介して）、あるいはＶ
L
領域のＣ末端がＶ
H
領域のＮ末端に連結されて（「ＬＨ」の配向で）構成された。
（Ｂ）BCMAを発現する腫瘍細胞に応答した、図１Ａに示したCARを発現しているヒトＴ細胞と、CARを含まない対照Ｔ細胞の増殖を示す、フローサイトメトリーデータ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE)染色）。
（Ｃ）指摘のBCMA
-
（K562）またはBCMA
+
（K562BCMA, U266, MM1.S）腫瘍細胞系と共に試験管内（in vitro）培養した時の、図１Ｂに示したCAR形質導入Ｔ細胞によるサイトカイン生産（IFN-γ）。
（Ｄ）BCMA CAR-T細胞による指摘の標的細胞系の特異的溶解。
（Ｅ）本開示の２つの典型的なCARの図。ここでスペーサー領域（Spacer+）は、タグカセット、リンカーモジュール、ヒンジ、スペーサーアミノ酸およびそれらの任意組み合わせを含むことができる。CARがスペーサー領域中に１以上のタグを含むならば、それは本明細書中に記載のT-ChARMと呼ばれるだろう。図の上側のCARは細胞外成分（BCMA特異的scFvおよび場合によりタグやリンカーのような別の要素を含むことがあるスペーサー領域からなる）、疎水性部分（CD28膜貫通ドメインからなる）および細胞内成分（CD3ζエフェクタードメインと4-1BB共刺激ドメインからなる）を含む。図の下側のCARは細胞外成分（BCMA特異的scFvおよび場合によりタグやリンカーのような別の要素を含むことがあるスペーサー領域からなる）、疎水性部分（CD28膜貫通ドメインからなる）および細胞内成分（CD3ζエフェクタードメインとCD28共刺激ドメインからなる）を含む。その２つのBCMA特異的CAR／T-ChARM構成物は両方とも、自己開裂性Thoseaasignaウイルス２A(T2A)ペプチド配列によりBCMA特異的CAR/T-ChARM構成物から分離された、先端切除型のヒトEGFR（EGFRt）を含む形質導入用遺伝子マーカーを含有する。別の既知の自己開裂性ペプチドも同様に使用でき、例えばブタのテッショウウイルス１ 2A（P2A)、ウマ鼻炎Ａウイルス（ERAV）2A（E2A)、および口蹄病ウイルス（FMDV）2A（F2A）が使用できる。
（Ｆ）様々な長さのスペーサー領域を有する典型的なCAR／T-ChARM構成物。sh＝12アミノ酸の短（Short）スペーサー；2ST＝２つのStrepタグカセットを有する48アミノ酸スペーサー；3ST＝３つのStrepタグカセットを有する66アミノ酸スペーサー；2ST Int＝２つのStrepタグカセットを有する157アミノ酸の中間長（Int）スペーサー；およびLo＝228アミノ酸の長（Long）スペーサー。短および長スペーサーは場合によりタグカセット、例えばStrepタグを含むことができる。
（Ｇ）C11またはA7 HL scFvを有しかつ異なるスペーサー領域（場合によりSTIIタグを含む）を有する典型的なCAR／T-ChARM構成物の追加の図。
（Ｈ）BCMA特異的CARで改変されたヒトＴ細胞のBCMA認識増殖能力は、Ｔ細胞をカルボキシフルオレセイン（CFSF）で標識し、全長BCMA（K562/BCMA）をコードするポリヌクレオチドにより形質導入されたK562細胞（K562/BCMA）と共に、CAR-T細胞または対照の未形質導入CFSE標識Ｔ細胞を培養し、そしてフローサイトメトリーを用いて各細胞分裂によるCFSEの希釈度を測定することにより測定した。異なるスペーサー長を有する異なるBCMA特異的CARを含むCFSE標識Ｔ細胞は、K562/BCMA細胞との共培養後にCFSEを希釈したが、対照の未形質導入Ｔ細胞（UT）はCFSEを希釈しなかった。2STまたはより長いスペーサーを含むCAR-T細胞は、短いスペーサーを発現するCAR-T細胞よりも良好に増殖した。
（Ｉ,Ｊ）BCMA発現U266および8266骨髄腫細胞に応答した、種々のスペーサー長を有する抗BCMA CAR-T細胞によるサイトカイン放出（IFN-γ、Ｉ；IL-2、Ｊ）。
（Ｉ,Ｊ）BCMA発現U266および8266骨髄腫細胞に応答した、種々のスペーサー長を有する抗BCMA CAR-T細胞によるサイトカイン放出（IFN-γ、Ｉ；IL-2、Ｊ）。
（Ｋ）単離および繁殖後の抗BCMA C11 T-ChARMまたはBCMA-2 CAR構成物を用いて形質導入されたCD8
+
Ｔ細胞上の細胞表面EGFRtおよびSTII発現。
（Ｌ,Ｍ）4-1BB共刺激ドメインまたはCD28共刺激ドメインを含む本開示のC11 T-ChARMを発現するように操作されたヒトCD4（上のパネル）およびCD8（下のパネル）Ｔ細胞による、または以前に開示された抗BCMA CAR（“BCMA-2”；Carpenter他、Clin. Cancer Res. 19:2048, 2013参照)による、サイトカイン放出（IFN-γ, Ｌ; IL-2, Ｍ)。
（Ｌ,Ｍ）4-1BB共刺激ドメインまたはCD28共刺激ドメインを含む本開示のC11 T-ChARMを発現するように操作されたヒトCD4（上のパネル）およびCD8（下のパネル）Ｔ細胞による、または以前に開示された抗BCMA CAR（“BCMA-2”；Carpenter他、Clin. Cancer Res. 19:2048, 2013参照)による、サイトカイン放出（IFN-γ, Ｌ; IL-2, Ｍ)。
（Ｎ）指示したBCMA発現細胞系と共培養した本開示のC11 T-ChARMまたはBCMA-2 CARを発現するように操作されたヒトＴ細胞の増幅。
（Ｏ）指示したＥ：Ｔ比において本開示のC11 T-ChARM（○＝41BB共刺激ドメイン、□＝CD28共刺激ドメイン）またはBCMA-2 CAR（△）を発現するように操作されたCD8 Ｔ細胞によるK562 BCMA陰性細胞の溶解。
（Ｐ）様々なＥ：Ｔ比（ｘ軸）における、図１Оに示した操作されたCD8 Ｔ細胞による、BCMAを発現するように遺伝子導入されたK562細胞の溶解。
図２Ａ～２Ｑは、培養物中の多発性骨髄腫（MM）細胞によるBCMAおよびPD-L1の産生と、腫瘍細胞を認識しIFN-γを生産する抗BCMA T-ChARM-T細胞の能力に対する可溶性BCMA（sBCMA）、表面結合型BCMAおよび表面結合型PD-L1の効果を示す。（Ａ）U266骨髄腫細胞を洗浄し培地中で１，３，５および24時間平板培養した。培地上清を収集し、ELISAにより可溶性BCMAについてアッセイした。データは、上清中の可溶性BCMAレベルの時間依存性増加を示す。
（Ｂ）ELISAにより測定された、高度（Pt.１）、中度（Pt.２）もしくは低度／陰性（Pt.３）発現を有する典型的な患者初代MM細胞によるまたは参照MM細胞（RPMI 8226）によるBCMA発現を示すヒストグラム（黒＝抗BCMA抗体；灰色の線＝アイソタイプ対照）。
（Ｃ）MM細胞での高度、中度または低度／陰性BCMA発現を有する骨髄腫患者（ｎ＝19）の割合を示すチャート。
（Ｄ）高度（左、ｎ＝５）または低度（右、ｎ＝４）BCMA発現を有する患者MM細胞での刺激に応答した、抗BCMA C11 T-ChARM
+
CD8
+
Ｔ細胞によるIFN－γの生産（2：1のＥ：Ｔ比で24時間（ELISA））。対応のない両側Ｔ検定を使って有意性を試験し、バーは平均IFN-γ生産＋SEMを示す。
（Ｅ）ELISAにより測定された、RPMI 8226骨髄腫細胞（最も左側のパネル）および高度、低度／陰性または中度PD-L1発現を有する３名の患者からの初代MM細胞によるPD-L1発現を示すヒストグラム（斜線陰影付き＝抗PD-L1抗体での染色；空白のヒストグラム＝アイソタイプ対照）。
（Ｆ）MM細胞中での高度、中度、または低度／陰性PD-L1発現を有する患者（ｎ＝19）の割合を示すチャート。
（Ｇ）高度（左、ｎ＝４）または低度（右、ｎ＝５）PD-L1発現を有する患者MM細胞に応答した、本開示の抗BCMA C11 T-ChARM
+
CD8
+
細胞によるIFN-γ生産（2：1のＥ：Ｔ比で24時間（ELISA））。対のない両側ｔ検定を使って有意性を試験し、バーは平均IFN-γ生産＋SEMを示す。
（Ｈ）外因性可溶性BCMAの存在下でのBCMA特異的T-ChARM Ｔ細胞によるIFN-γ生産。sBCMAは、BCMA特異的T-ChARM細胞を発現するＴ細胞と全長BCMAをコードするポリヌクレオチドにより形質導入されたK562細胞（K562／BCMA
+
）との共培養物に添加された。培地上清中へのIFN-γ放出により測定した時にBCMA特異的T-ChARM T細胞エフェクター機能の用量依存性阻害が認められる。
（Ｉ）K562 BCMA
+
細胞を認識するBCMA特異的T-ChARM T細胞によるIFN-γ生産に対するsBCMAの効果を示す別の用量滴定実験であって、sBCMAを別の、より高濃度（5,000 ng/mL）で培養物に添加することを含む実験からのデータ。
（Ｊ）インビトロで培養された指摘のMM細胞によるBCMAの脱落。
（Ｋ）低（＜２％CD138
+
細胞）または高（＞２％CD138
+
細胞）疾病負荷を有する患者からの骨髄（BM）血清において測定されたsBCMA。
（Ｌ）本開示のC113ST-ChARM T細胞へのsBCMA結合。Ｔ細胞を指示したレベルの組換えsBCMAと共にインキュベートし（図の右側）、次いでAPCに結合されたBCMA-Fc融合体により染色した。
（Ｍ）C113ST T-ChARM細胞とFMC63 CAR-T細胞による、表面染色（APCと結合されたBCMA-Fcおよび抗EGFRt抗体）およびCD4発現を示すフローサイトメトリーデータ。
（Ｎ）標的を発現するK562細胞と共に共培養しそしてBCMA-Fc融合タンパク質を投与した時（左のパネル：0 ng/mL BCMA-Fc；右のパネル：1000 ng/mL BCMA-Fc）の、本開示のC113ST-ChARM（「C113ST」）または対照の抗CD19 CAR（「FMC632」）のいずれかを発現するＴ細胞による、IFN-γ生産（ｙ軸）およびCD4発現（ｘ軸）を示すフローサイトメトリーデータ。
（Ｏ）外因性組換えBCMA（BCMA-Fc融合体）の存在下または非存在下での指摘のような標的細胞系に応答したCAR T細胞によるIFN-γ放出を示す用量滴定。FMC63（抗CD19）対K562 CD19
+
（対照；下向きの三角形▽）； C113ST T-ChARM T細胞対RPMI 8226 (上向きの三角形△)、U266 (正方形□)およびK562 BCMA
+
細胞（円○））。データは、２種の独立した実験を代表するものである。バーは、平均＋SEMを表す。P値（事後試験を伴う一方向ANOVAにより求めた）≦0.05。MFI＝平均蛍光強度。
（Ｐ）BCMA-Fcの存在下または非存在下での（ｘ軸）指示した抗原発現細胞との共培養物における図２Оに示されるＴ細胞によるIFN-γ生産（正規化平均蛍光強度、MFI）。
（Ｑ）K562 BCMA
+
標的細胞に対するCD8
+
C113ST T-ChARM Ｔ細胞の、およびK562 CD19
+
標的細胞に対するFMC63 CAR-T細胞の、様々な濃度の組換えBCMAにおいて10：1のＥ：Ｔ比における４h CRAにより分析された、細胞溶解活性。データは２種の独立した実験の代表である。バーは平均＋SEMを表す。P値（事後試験を伴う一方向ANOVAにより求めた）≦0.05。MFI＝平均蛍光強度。
図３Ａ～３Ｒは、骨髄腫細胞株または初代骨髄腫細胞の細胞表面BCMAおよび他の細胞表面分子のレベルに対するγ－セクレターゼ阻害剤（GSI）RO4929097の効果を示す。（Ａ）細胞表面のBCMAを、骨髄腫細胞株（8226、U266B1、MM1.R、H929）を０μM（DMSO対照）～1.0μMの濃度範囲のGSI RO4929097と共にインキュベーションする前と５時間後に（図を参照）、抗BCMAモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより前記４種の骨髄腫細胞株に関して測定した。
（Ｂ）指示濃度のRO4929097と共に培養したMM.1R細胞による表面BCMA発現；アイソタイプ対照（灰色の線）と比較した抗BCMA抗体（黒い線）による染色。
（Ｃ）指示濃度のRO4929097と共に培養した時のMM細胞株による表面BCMA発現の変化（倍）。変化（倍）は、同じ細胞系の未処置MM細胞と比較して示される。
（Ｄ）1μM RO4929097との培養物における指摘のMM細胞による経時的な表面BCMA発現の変化（倍）の反応速度論。
（Ｅ）U266骨髄腫細胞を様々な濃度のGSI RO429097（0.01μM、0.1μM、1.0μM）の存在下で1、3、5、24時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより表面BCMA発現を評価した。BCMA発現は、GSIの存在下で用量依存形式で増加し、５時間の暴露後に最大の増加が観察された。
（Ｆ）1μM GSI中で培養した細胞株（MM1R＝三角形△；U266＝正方形□；8226＝円○）上の表面BCMA発現の経時的な変化（倍）。GSIは、２日毎の培地の半量の交換として再投与された。BCMAの変化（倍）は、処置群（MFIBCMA－MFIiso）／対照群（MFIBCMA－MFIiso）として定義される。データは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。
（Ｇ,Ｈ）指示濃度のRO4929097の存在下で培養されたMM細胞株細胞におけるsBCMAの培養上清濃度。
（Ｇ,Ｈ）指示濃度のRO4929097の存在下で培養されたMM細胞株細胞におけるsBCMAの培養上清濃度。
（Ｉ）U266骨髄腫細胞を洗浄し、様々な濃度のGSI RO429097（0.01μM、0.1μMおよび1.0μM）の存在下で培地中で平板培養した。培地上清を1、3、5および24時間後に回収し、ELISAにより可溶性BCMA（sBCMA）についてアッセイした。データは、GSIが少なくとも約0.01μMの濃度で存在すると、腫瘍細胞から上清中に放出されるBCMAの量が経時的に減少したことを示す。
（Ｊ,Ｋ）GSIの連続した存在下での培養物（GSI +/+）に比較した、骨髄腫細胞株培養物から1μM GSIを除去した後（GSI +/-）の様々な時点でのBCMA発現（Ｊ）および上清sBCMA濃度（Ｋ）の変化（倍）。
（Ｊ,Ｋ）GSIの連続した存在下での培養物（GSI +/+）に比較した、骨髄腫細胞株培養物から1μM GSIを除去した後（GSI +/-）の様々な時点でのBCMA発現（Ｊ）および上清sBCMA濃度（Ｋ）の変化（倍）。
（Ｌ）1μM GSI中で培養した細胞株のヨウ化プロピジウム染色により測定した、指示MM発現細胞の生存率。
（Ｍ）指示濃度のRO4929097と共に培養した初代患者MM細胞による表面BCMA発現。染色は、図３Ｂに関して記載した通りであった。
（Ｎ）様々な量のGSIと共に４時間培養した初代骨髄腫細胞（ｎ＝７）上のBCMAの変化（倍）。初代細胞および細胞系は0.5×10
6
細胞/mLで培養した。BCMAの変化（倍）は、処置群（MFI
BCMA
－MFI
iso
）／対照群（MFI
BCMA
－MFI
iso
）として定義される。データは、異なるドナー由来のＴ細胞を使用した３つの独立した実験の代表である。
（Ｏ,Ｐ）様々な濃度のGSIとの初代骨髄腫細胞の４時間の共培養は、CS1、CD86、PD-L1、CD80およびCD38を含む腫瘍細胞上の数種の別の細胞表面分子のレベルに影響を与えない。
（Ｏ,Ｐ）様々な濃度のGSIとの初代骨髄腫細胞の４時間の共培養は、CS1、CD86、PD-L1、CD80およびCD38を含む腫瘍細胞上の数種の別の細胞表面分子のレベルに影響を与えない。
（Ｑ）培地中の1μM GSIの存在下（黒色）または非存在下（灰色）でのMM1R細胞上の様々な表面マーカーの染色。アイソタイプ染色はオープンプロットとして示される。
（Ｒ）CD138
+
初代骨髄腫細胞を患者の骨髄試料から濃縮し、様々な濃度のGSI RO4929097（0.01μM～10μM）の存在下で３時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより表面BCMA発現について評価した。腫瘍細胞のBCMA平均蛍光強度（MFI）は、RO4929097不在下でインキュベートした腫瘍細胞で観察されたものを超える増加の倍数として表される。BCMAの用量依存形式でのアップレギュレーションが観察される。
図４Ａ～４Ｃは、骨髄腫細胞をGSIで前処理するとBCMA特異的CAR-T細胞による初代骨髄腫細胞の認識後サイトカイン放出が増加することを示す。（Ａ）単独でまたは様々な濃度のGSI RO4929097（0.003μM～3.0μM）存在下での初代ヒト骨髄腫細胞と共に24時間共培養したBCMA CAR-T細胞（BCMA特異的T-ChARM C113ST-CD28およびBCMA特異的T-ChARM C11 3ST-41BB）によるまたは対照のCD19sh CAR（短スペーサー）-T細胞によるIL-2生産。
（Ｂ）様々な濃度のRO4929097の存在下で骨髄腫細胞と共に共培養したBMCA T-ChARM T細胞によるIFN-γ生産。
（Ｃ）CFSE標識したBCMA特異的T-ChARM T細胞の増殖は、培地のみまたは指定濃度のGSI RO492097を含む培地中での初代ヒト骨髄腫細胞と共に３日間共培養した後、用量依存形式で増加した。
図５Ａ～５Ｒは、CAR-T細胞の生存率、増殖および機能的活性に対する様々な濃度のGSIの効果を示す。（Ａ）GSIと共にまたは無しで±12～16時間培養したK562 CD19
+
細胞およびRaji細胞のCD19染色。アイソタイプ対照は灰色の線で示される。
（Ｂ）初代ヒトＴ細胞を0.01μM～100μMの範囲の濃度のGSI RO4929097中で培養し、そして24時間後にトリパンブルー色素排除により生存率を測定した。Ｔ細胞の生存率に対するGSIの影響はどの濃度においても認められなかった。
（Ｃ）様々な濃度のRO4929097を含む培地中で、CD19 CAR-T細胞をK562/CD19標的細胞と共に共培養した。RO4929097は、IL-2（上のパネル）およびIFNγ（下のパネル）の生産を測定することにより決定されるように、共培養すると≧３μMの濃度でCD19 CAR-T細胞エフェクター機能を阻害する。ボックスは、CAR-T細胞エフェクター機能を阻害しない薬物の関連治療濃度域を示す。
（Ｄ）増加する濃度のGSI RO4929097の存在下で標的細胞と共に培養したCD19 CAR-T細胞によるIL-2産生。
（Ｅ）増加する濃度のGSI RO4929097の存在下で標的細胞（“K562 CD19”）または対照細胞（“K562 BCMA”）と共に培養したCD19 CAR-T細胞によるIL-2産生。細胞に指示量のGSIを投与した後、洗浄し（空白のバー）または洗浄しなかった（塗りつぶしたバー）。
（Ｆ）様々な濃度のGSIとのプレインキュベーション後、K562 BCMA
+
またはK562 CD19
+
細胞と共に一晩共培養した後のCD19 CAR-T細胞によるIL-2産生を示す別の実験からのデータ。洗浄後、サイトカイン産生の可逆性を評価するために、GSIを共培養物に再び添加し（+/+）または共培養物から除外した（+/-）。
（Ｇ）GSI RO4929097の存在下でのCD19 CAR-T細胞による指摘の標的細胞または対照細胞の特異的溶解。
（Ｈ）GSIの存在下もしくは非存在下でCD19発現標的細胞と共に培養された、またはGSIの非存在下で対照細胞と共に培養された、CD19 CAR-T細胞の増殖。細胞をCFSEで染色し、フローサイトメトリーにより増殖を測定した。
（Ｉ）指示濃度のGSI RO4929097の存在下でのCD19 CAR-T細胞の細胞分裂数のグラフ表示。水平バーの幅は、実験の過程に渡って指示世代数（すなわち5、4、3、2、1、または0世代）だけ細胞分裂した培養物中のCAR-T細胞の比率を表す。
（Ｊ）GSIの非存在下（円形○）または0.5μM（四角形□）もしくは5μM（三角形▽）の存在下での、CD19
+
TM LCL細胞および外因性IL-2を含むCD19特異的CAR-T細胞の増殖中の細胞計数（CD8染色）。
（Ｋ）指摘の通りGSIの非存在下または存在下でのCD19
+
TM.LCL細胞と共に増殖させたCD19特異的CAR-T細胞（CD4：CD8（1：1）の細胞計数。ただし外因性IL-2の添加は伴わない。
（Ｌ）K562細胞（抗原なし）、K562 CD19
+
細胞またはRaji細胞による再刺激後にGSI存在下で増殖させた抗CD19 CAR CD8
+
Ｔ細胞の上清中のIFN-γ濃度。
（Ｍ,Ｎ）GSIの非存在下でまたは0.5μMもしくは5μM GSIのいずれかの存在下での指摘の細胞株による再刺激後のCD4：CD8抗CD19 CAR-T細胞混合物によるIFN-γ（Ｍ）およびIL-2（Ｎ）の生産。
（Ｍ,Ｎ）GSIの非存在下でまたは0.5μMもしくは5μM GSIのいずれかの存在下での指摘の細胞株による再刺激後のCD4：CD8抗CD19 CAR-T細胞混合物によるIFN-γ（Ｍ）およびIL-2（Ｎ）の生産。
（Ｏ）GSI RO4929097の非存在下（0μM；左のパネル）または存在下（１μM；右のパネル）で２人の患者由来の初代MM細胞と共に培養した本開示のT-ChARM T細胞によるIFN-γ生産（ｙ軸）およびCD8発現（ｘ軸）を示す細胞内染色。
（Ｐ）指示濃度のRO4929097（ｘ軸）の存在下で初代MM細胞と共に培養した本開示のT-ChARM T細胞によるIFN-γ産生（幾何平均蛍光強度（gMFI））。
（Ｑ）指示濃度のRO4929097（ｘ軸）の存在下で初代MM細胞と共に培養した本開示のT-ChARM T細胞によるIFN-γ産生（正規化MFI；ｙ軸）。
（Ｒ）未処置（灰色の網掛け）または1.0μM GSI RO4929097で処置した初代MM細胞の存在下での本開示のT-ChARM T細胞の増殖。
図６Ａ～６Ｃは、多発性骨髄腫の前臨床インビボモデルでのBCMA発現に対するGSI RO4929097の作用を示す。（Ａ）播種性異種移植マウス骨髄腫モデルのための実験スキーム。NSGマウスを照射（275 rad）して腫瘍の生着を促進し、ヒトMM腫瘍細胞（5×10
6
MM.1R）を投与した後、GSI処置（30 mg/kg）を行った。その後、マウスを安楽死させ、血液およびBM試料を採取し、GSIがインビボで骨髄腫細胞上のBCMA発現をアップレギュレートしたかどうかを判定した。
（Ｂ）２回目のGSI投与後、指定の時点で安楽死させたマウスの骨髄腫細胞上の表面BCMA発現の変化（倍）。
（Ｃ）RO4929097の投与後、指定された時点で犠牲にしたマウスの血清中のsBCMAレベル。
図７Ａ～７Ｅは、前臨床マウスMMモデルにおける抗BCMA CAR-T細胞療法に対するGSI RO4929097の効果を示す。（Ａ）マウスに放射線を照射し、その後ヒトMM腫瘍細胞（ホタルルシフェラーゼを発現する5×10
6
MM.1R）を投与する実験スキーム。それから20日後、指摘の時点でマウスにGSI（30 mg/kg）を投与し、第０日に抗BCMA T-ChARM T細胞（0.33×10
6
細胞、1：1 CD4：CD8）の単回準最適投与量を投与した。生物発光（BLI）画像と生存率を全期間にわたりモニタリングした。
（Ｂ）C113ST T-ChARM T細胞（0 mg/kgの0.33×10
6
細胞、1：1 CD4：CD8、左のパネル; 30 mg/kg、中央のパネル）または対照のFM63抗CD19 CAR-T細胞（0.33×10
6
細胞、1：1 CD4：CD8、30 mg/kg、右のパネル）での処置後２日目、17日目および16日目に撮影したマウスのBLI画像。
（Ｃ）図８Ｂに示すBLIからの定量的発光データ。
（Ｄ）T-ChARM T細胞の投与後の図８Ｂに示すマウスの生存率。
（Ｅ）（左）図８Ｂに示すBLIからの定量的発光データ。（右）T-ChARM T細胞の投与後のマウスの生存率。
図８は、BCMAに特異性を有する二重特異性融合分子による、GSIの存在下または非存在下でのH929 MM細胞への結合のフローサイトメトリー分析を示す。BCMAをターゲットとしない対照の二重特異性融合分子も試験した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で用いる特定の用語の定義を提供することは、本発明の理解に役立つだろう。追加の定義は本開示の全体にわたって与えられる。
【０００９】
本明細書において、任意の濃度域、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲は、別記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合には、その分数（例えば、ある整数の1/10および1/100）を包含すると理解すべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さといったいずれかの物理的特徴に関連して本明細書に列挙される数値の範囲は、特に別記しない限り、列挙された範囲の中の任意整数を含むと理解される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別記しない限り、指示された範囲、値または構造の±20％を意味する。本明細書で使用される「ａ」および「an」という用語は、指摘された構成要素の「１つまたは複数」を指すことを理解されたい。選択肢の使用（例えば「または」）は、選択肢のいずれか１つ、２つまたはその任意組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される「包含する」、「有する」および「含む」という用語は同義語として用いられ、それらの用語および変形は非限定的であると解釈されるべきである。
【００１０】
加えて、本明細書に記載の構造および置換基の様々な組み合わせから誘導される個々の化合物または化合物群は、各化合物または化合物群があたかも個別に言及されたのと同程度に本願により開示されることを理解すべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
（【００１１】以降は省略されています）

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