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公開番号2024157566
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-07
出願番号2024127778,2022099209
出願日2024-08-02,2014-12-12
発明の名称最適化機能CRISPR-Cas系による配列操作のための系、方法および組成物
出願人ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド,マサチューセッツ・インスティトュート・オブ・テクノロジー,国立大学法人東京大学,プレジデントアンドフェローズオブハーバードカレッジ
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】標的遺伝子配列および関連遺伝子産物の発現を変更するための系、方法、および組成物を提供する。
【解決手段】CRISPR-Cas系のCasタンパク質に関する構造情報、CRISPR複合体の改変成分の生成におけるこの情報の使用、CRISPR複合体の1つ以上の成分または改変成分をコードするベクターおよびベクター系、ならびにそのようなベクターおよび成分を設計および使用する方法が提供される。真核細胞中でCRISPR複合体形成を指向する方法およびCRISPR-Cas系を利用する方法も提供される。特に、本発明は、最適化機能CRISPR-Cas酵素系を包含する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、前記ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、前記アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している組成物。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
請求項１に記載のｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、天然に存在しないまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し；および／または
少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、
請求項２に記載の天然に存在しないまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物。
【請求項４】
１つ以上の機能ドメインと会合している１つ以上のアダプタータンパク質が存在し、前記ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループ中に挿入された区別されるＲＮＡ分子に結合している、請求項１に記載のｓｇＲＮＡまたは請求項２もしくは３に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
【請求項５】
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、
少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素
を含み、
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し、
少なくとも１つのｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、
前記アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している
組成物。
【請求項６】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して少なくとも９７％、または１００％縮小したヌクレアーゼ活性を有する、請求項２、３、４または５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、２つ以上の突然変異を含み、ＳｐＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、もしくはＤ９８６もしくはＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０の２つ以上が突然変異しており、または前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくとも１つのＨ８４０が突然変異している、請求項２、３、４、５または６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳｐＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３ＡもしくはＤ９８６Ａ、もしくはＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０Ａを含む２つ以上の突然変異、またはＨ８４０Ａを含む少なくとも１つの突然変異を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳｐＣａｓ９タンパク質または任意の対応するオルソログによるＨ８４０Ａ、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ、またはＤ１０ＡおよびＮ８６３Ａを含む、請求項２、３、４、５または６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、
ＳａＣａｓ９タンパク質もしくは任意の対応するオルソログによるＮ５８０Ａまたは；
ＳｐＣａｓ９タンパク質、もしくは任意の対応するオルソログによるＤ１０Ａ、およびＳａＣａｓ９タンパク質によるＮ５８０Ａ
を含む、請求項２、３、４、５または６のいずれか一項に記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願および参照による組み込み
本出願は、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；２０１４年１月２２日に出願された同第６１／９３０，２１４号明細書；２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日に出願された同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年９月２５日に出願された同第６２／０５５，４８４号明細書；２０１４年１１月４日に出願された同第６２／０８７，５３７号明細書；２０１３年１２月１２日に出願された同第６１／９１５，２６７号明細書；および２０１４年２月１２日に出願された同第６１／９３９，２５６号明細書からの優先権を主張する。
続きを表示（約 2,700 文字）【０００２】
上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物に関する。特に、本発明は、最適化機能ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素系を包含する。
【０００４】
連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈにより助成されたＮＩＨパイオニアアワードＤＰ１ＭＨ１００７０６のもと政府支援を受けて作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００５】
本発明は、ＪＳＴ（科学技術振興機構）により２０１２年に助成された「ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術」の分野におけるＰＲＥＳＴＯ（戦略的創造研究推進事業、さきがけ）のもと政府支援を受けて作製された。ＪＳＴは、本発明において一定の権利を有する。
【０００６】
本発明は、ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｐｏｒｔｓ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＥＸＴ）により２０１４年に助成された“ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＮｅｗＣＲＩＳＰＲＣａｓ９ＳｙｓｔｅｍＳｅｔａｎｄＩｔｓＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”の分野のもと政府支援を受けて作製された。ＭＥＸＴは、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００７】
ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタム化タンパク質の生成を要求しないが、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。
【０００９】
一態様において、本発明は、天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、細胞中の目的ゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する区別されるＲＮＡ配列の挿入物により改変されており、アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと会合している組成物を提供する。２つ以上の機能ドメインが存在する場合、機能ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、例えば、２つの同一または２つの異なるアクチベーターまたはリプレッサーであり得る。一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物を提供する。一態様において、本発明は、本明細書に記載の天然に存在しないまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体組成物であって、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、少なくとも１つの突然変異を含み、その結果、ＣＲＩＳＰＲ酵素が少なくとも１つの突然変異を有さないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有し；および／または少なくとも１つ以上の核局在化配列を有する組成物を提供する。
【００１０】
一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｇＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体であって、１つ以上の機能ドメインに会合している１つ以上のアダプタータンパク質が存在し、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループ中に挿入された区別されるＲＮＡ配列に結合している複合体を提供する。
（【００１１】以降は省略されています）

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