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公開番号2024144435
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-11
出願番号2024111946,2022569478
出願日2024-07-11,2021-11-23
発明の名称AAVを産生する方法
出願人ツェヴェックファーマシューティカルズゲーエムベーハー
代理人個人,個人,個人
主分類C12N 5/10 20060101AFI20241003BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明が解決しようとする課題は、AAVベクターを安定して産生する拡大縮小可能なシステムを提供することである。
【解決手段】本発明は、安定なAAVプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、AAVの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、AAV産生工程の間に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がAAV産生の誘導後に続く、工程とを含む、アデノ随伴ウイルスを産生する方法に関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
（ａ）安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、
（ｂ）ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に前記細胞を灌流培養で培養する工程であって、前記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との前記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後少なくとも２４時間にわたって続く、工程と、
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法であって、
少なくとも以下の遺伝子：
ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、並びに、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、
が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれ、
前記安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株が、ＣＡＰ細胞又はＨＥＫ２９３細胞から選択される細胞株である、方法。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
少なくとも以下の遺伝子：
ＡＡＶＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子、
ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８をコードする遺伝子、
ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードする遺伝子、
アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ２Ａをコードする遺伝子、並びに、ＡＡＶＩＴＲが隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）、
が前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ８、ＡＡＶｒｈ１０、２つ以上の異なる前記血清型の混成物及びＡＡＶ血清型の向性を変化させる突然変異を有する前記血清型からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする遺伝子が、ＡＡＶＣａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子；ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子；アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２Ａ及びＶＡ－ＲＮＡをコードする遺伝子；Ａｄ５ヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする遺伝子；並びにＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
以下の更なる遺伝子：
ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８との両方をコードする遺伝子、
ＡＡＶＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２とＲｅｐ４０との両方をコードする遺伝子、及び、アデノウイルスのヘルパー機能Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂのいずれか一方又は両方をコードする１つの遺伝子又は複数の遺伝子
が、前記宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
灌流培養が、撹拌槽バイオリアクター（ＳＴＲ）、軌道振盪バイオリアクター（ＯＳＢ）、ロッキングベッドバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、管状バイオリアクター、中空糸バイオリアクター（ＨＦＢＲ）、固定床バイオリアクター又は流動床バイオリアクター中で実施される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
灌流培養に使用される灌流デバイスが、ＴＦＦ（接線流濾過）モード又はＡＴＦ（交互接線流）モードで使用される中空糸フィルター；浮遊膜、スピンフィルター、回転筒状フィルター、回転ディスクフィルター、遠心分離機、重力沈降機、ラメラ沈降機、小型細胞沈降機、アコースティック沈降機又は液体サイクロンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
灌流培養のために使用される前記灌流デバイスがＡＴＦモードで使用される中空糸フィルターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
使用済培地の新鮮な培地との前記連続的な置換が、ＡＡＶ産生の誘導後少なくとも４８時間又は少なくとも７２時間にわたって、及び／又はＡＡＶの回収まで続く、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）が約０．０１ｎＬ／細胞／日～約０．２０ｎＬ／細胞／日である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定なＡＡＶプロデューサー宿主細胞株を準備する工程であって、ＡＡＶの産生に必要な成分をコードする少なくとも幾つかの又は全ての遺伝子が、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれる、工程と、ＡＡＶ産生工程の間（すなわち、Ｎ工程の間）に上記細胞を灌流培養で培養する工程であって、上記灌流培養が、使用済培地の新鮮な培地との連続的な置換を包含し、使用済培地の新鮮な培地との上記連続的な置換がＡＡＶ産生の誘導後に続く、工程とを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生する方法に関する。
続きを表示（約 2,600 文字）【背景技術】
【０００２】
最近、ＡＡＶ由来のベクターに基づく遺伝子療法の治験及び製品の数が急速に増加している。遺伝子療法におけるＡＡＶベクターの利点は、優れた安全性プロファイル、そのようなベクターは病原性でない、すなわち、あらゆる疾患と関係がないという事実、導入遺伝子の長期の発現、並びに分裂細胞及び非分裂細胞を形質導入する可能性である。しかし、この有望な研究を臨床開発に移行させるための主な課題は、かなりの量のＡＡＶウイルスベクターを高品質で送達するという課題である。
【０００３】
組換えＡＡＶの産生は、トランスで供給される組換えウイルスの産生のために、通常ＡＡＶゲノムにコードされるＡＡＶＲｅｐ及びＣａｐタンパク質の発現を特に必要とする。さらに、異なるヘルパーウイルスに由来し得るヘルパー遺伝子が使用され、最も一般的なものは、アデノウイルス（ＡＶ）から得られるヘルパーウイルス遺伝子、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６又はＶＡＲＮＡである。さらに、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むトランスファーベクターが必要とされる。
【０００４】
ＡＡＶの現在の産生システムは、以下の技術に大抵依拠するが、幾つかの欠点がある。
【０００５】
組換えＡＡＶを産生する最も一般的なシステムは、ＡＡＶ産生に必要である全ての遺伝子を一過性トランスフェクションによって産生細胞中に導入することに依拠する。一過性トランスフェクションは、通常、２つ又は３つのプラスミドシステム：目的の遺伝子を含むトランスファーベクター；アデノウイルスのヘルパー機能を有するｐＨｅｌｐｅｒ；並びにカプシド及びレプリカーゼ機能を供給するｐＡＡＶ－Ｒｅｐ２ＣａｐＸ（ＣａｐＸ＝異なるＡＡＶ血清型のカプシド機能）を必要とする。しかし、このアプローチには幾つかの欠点がある。特に、一過性トランスフェクション工程が理由で、この方法は、高費用のプラスミドＤＮＡを必要とし、十分な拡大縮小性、頑強性及び再現性を欠く。
【０００６】
また、一過性トランスフェクションの工程は、大規模な培地及び供給最適化、並びにｐＨ、温度又は細胞密度のようなプロセスパラメーターの産生中の変動のような、他の組換え型生物学的製剤の産生でよく見られる生成物の力価又は生成物の品質を高めるための或る特定のプロセス最適化工程を妨害する。特に、後者は、全体的な生成物の力価を高めるための有望なアプローチである。より高い細胞密度は、一般に、細胞特異的生産性が低下しない限り、力価が高まることにつながる（「細胞密度効果」）。特に、一過性トランスフェクションを使用している間は、細胞密度を高めると同時に細胞特異的生産性が低下する場合がある。これは、特に、ウイルスベクターの産生についても記載されている。
【０００７】
ＡＡＶの産生は、特定の産生プロセスとは無関係に、ＡＡＶＩＴＲが隣接するパッケージングされた目的の遺伝子（ＧＯＩ）を意味する完全なＡＡＶ粒子と、パッケージングされたＧＯＩを含まない空粒子との混合物を常にもたらす。例えばＨＥＫ２９３細胞等の哺乳動物懸濁細胞の一過性トランスフェクションによって達成されるＡＡＶの力価は、プロセスに応じて、１×１０
１３
ｖｇ／Ｌ（ウイルスゲノム／Ｌ）～１×１０
１５
ｖｇ／Ｌの範囲である。一過性トランスフェクションによって、完全な粒子の割合は最大で約３０％の完全な粒子と報告されたが、通常は１０％～１８％の範囲である。これは、８２％～９０％が望ましくない空粒子であることを意味する。空粒子は治療的に不活性であり、患者の免疫応答を高める可能性がある。したがって、産生後の精製プロセスにおいて、これらの空粒子は、できるだけ効率的に除去されなければならない。これは、有効であるが、拡大縮小可能ではないプロセスである遠心分離を介するか又はクロマトグラフィー法によるかのいずれかで達成することができる。後者は、大量産生にも利用可能であるが、完全な粒子の倍数濃縮は通常たった約３倍～６倍の範囲である。したがって、例えば、およそ１０％の完全な粒子をともなう試料の濃縮は、たった約３０％～６０％の完全な粒子という最終的な割合をもたらす。
【０００８】
既に安定して組み込みこまれた目的の遺伝子を有する、いわゆるプロデューサー細胞株は、ＨＥＫ細胞又はＨｅＬａ細胞に大抵基づく。しかし、これらは、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスによる更なる感染を必要とする。ＡＡＶ産生中のヘルパーウイルスのこの追加は、対応するヘルパーウイルスの最初の産生の後に、産生されたＡＡＶベクターの大規模な精製により最終的な生成物からヘルパーウイルスを除去すること、及び費用をかけてヘルパーウイルスが存在しないことを証明することを必要とする。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのシステムにも同じことが当てはまる。さらに、バキュロウイルスベースのシステムは、十分な拡大縮小性及び頑強性を欠き、昆虫宿主細胞タンパク質及び免疫原性の昆虫細胞特異的グリコシル化構造物が混入する危険性を加える。
【０００９】
したがって、現在のＡＡＶ産生システムは、拡大縮小性、頑強性、再現性、使いやすさ及び費用効率に関してだけでなく、生成物の品質に関しても制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、特に、生成物の力価及び／又は細胞特異的収率及びさらにいっそう重要なことに、特に完全な粒子の割合の点から生成物の品質を高めることを目的として、一過性トランスフェクション又はヘルパーウイルスを必要とせず、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの頑強な、産業的及び拡大縮小可能な産生、並びに大規模な上流プロセスの開発の最適化を可能にする、ＡＡＶベクターを安定して産生する拡大縮小可能なシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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