特許ウォッチ

公開番号2024128054
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-20
出願番号2024109940,2022160290
出願日2024-07-09,2017-12-04
発明の名称グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定
出願人キッコーマン株式会社
代理人弁理士法人平木国際特許事務所
主分類C12Q 1/32 20060101AFI20240912BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】溶存酸素の影響を受けにくく、長期間のモニタリング可能な持続血糖測定方法、
及びそのためのデバイスを提供すること。
【解決手段】本発明は、(a) pH 7.0にて40℃で1週間にわたり加温した場合に、初期活性
100%のうち、35%以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は(b) pH 7.0にて
40℃で2週間にわたり加温した場合に、初期活性100%のうち、22%以上のデヒドロ
ゲナーゼ活性が保持される、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FAD-GDH)を用いる
、持続血糖測定方法及び装置に関する。さらに脱糖鎖処理されたグルコースデヒドロゲナ
ーゼ及び糖鎖付加部位の改変されたグルコースデヒドロゲナーゼが提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
(a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、３５
％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる、グルコース測定方法。
続きを表示（約 2,200 文字）【請求項２】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４又は
２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたものである
、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたものであ
るか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、請求項２に記
載の方法。
【請求項５】
前記糖鎖付加部位の改変が、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247位
、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び550
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
(a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、３５
％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含むグルコースセンサーを備えてな
る、連続グルコースモニタリングデバイス。
【請求項７】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４又は
２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたものである
、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたものであ
るか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、請求項７に記
載のデバイス。
【請求項１０】
配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１２、１４又は２２と７０％以上のアミノ
酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247
位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び55
0位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、糖鎖付加部位の改変を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、低
減された糖鎖を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定方法及び装置に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病の診断及び
管理には、連続グルコースモニタリング（CGM）システムが重要である。CGMシステムは数
日～１、２週間の期間、血中グルコースレベルを測定することが出来る。CGMシステムは
グルコースセンサーを有する。CGMは、持続血糖測定、或いは連続グルコースモニタリン
グと呼ばれる（本明細書ではこれらの用語は相互に置き換え可能とする）。
【０００３】
グルコースレベルの測定はグルコースオキシダーゼ(GOD)を用いて行うことができる。G
ODはグルコースを酸化する際に、酸素を電子受容体とする。これは測定サンプル中に存在
する溶存酸素の影響を受けうる。我々の知る限り、現在の市販CGMデバイスはいずれもGOD
に基づく。特定のGOD、例えばアスペルギルス属、例えばAspergillus niger等の微生物に
由来するGODは、過酷な熱条件下でも活性を保持することが知られている（非特許文献１
）。そのため、CGMデバイスでは、一般に、熱安定なGODが用いられている。
【０００４】
Burkholderia cepacia由来のGDHを用いてCGMデバイスの構築が検討されている。しかし
ながら、GODを用いたCGMやBurkholderia cepacia由来のGDHを用いて構築したCGMデバイス
は、１日に数回のキャリブレーションが必要である（例えば非特許文献２）。これはGOD
やGDHが時間経過により失活しているからであると考えられる。
【０００５】
特許文献１は、ムコール属由来のGDHを開示している。
非特許文献３はMucor prainii由来のFAD-GDHを開示している。当該文献には、GOD（E.C
. 1.1.3.4）がその高い熱安定性と高いグルコース選択性のため、アンペロメトリー用グ
ルコースセンサーとして広く使用されてきたことが記載されている。
【０００６】
特許文献２は、Burkholderia cepacia由来のGDHを開示している。開示されているGDHは
膜結合性タンパク質であり、シトクロムドメインを有する。B. cepacia由来のGDHのアミ
ノ酸配列はムコール属由来のFAD依存性GDHと類似していない。
【０００７】
特許文献３はMucor guilliermondii (MgGDH)由来のGDHを開示している。
特許文献４はMucor hiemalis (MhGDH) 由来のGDHを開示している。この文献には、MhGD
HのSMBG用センサーへの応用が開示されている。
【０００８】
特許文献５はCircinella simplex由来のCsGDH及びCircinella sp.由来のCRGDHを開示し
ている。
【０００９】
特許文献６はMucor RD056860由来のMrdGDHを開示している。この文献には、MrdGDHのSM
BG用センサーへの応用が開示されている。
【００１０】
特許文献７はMucor subtilissimus由来のMsGDHを開示している。
特許文献８及び特許文献９は、それぞれ、M. prainii由来のGDHを開示している。
非特許文献４は、セロビオースデヒドロゲナーゼを用いた酵素センサーについて、脱糖
鎖により応答電流が上がる、すなわちセンサー感度が上がることを記載している。しかし
ながら一般的に、糖鎖修飾された酵素について脱糖鎖を行うと、安定性が低下することが
知られていた（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許