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公開番号2024126228
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-20
出願番号2023034473
出願日2023-03-07
発明の名称可溶性が向上したFc結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C12N 15/12 20060101AFI20240912BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】従来のヒトFcRnに対して可溶性が向上したFc結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供すること。
【解決手段】 N末端側から、ヒト新生児Fcレセプター(FcRn)β鎖のβ2ミクログロブリン領域、FcRnα鎖の細胞外領域、FcRnβ鎖のβ2ミクログロブリン領域の順に連結した、Fc結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤により、前記課題を解決する。
【選択図】図3
特許請求の範囲【請求項１】
Ｎ末端側から、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）β鎖のβ２ミクログロブリン領域、ＦｃＲｎα鎖の細胞外領域、ＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域の順に連結した、Ｆｃ結合性タンパク質。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
ＦｃＲｎα鎖の細胞外領域が、以下の（Ａ－１）から（Ａ－３）のいずれかから選択される、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質；
（Ａ－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（Ａ－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（Ａ－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域が、以下の（Ｂ－１）から（Ｂ－３）のいずれかから選択される、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質；
（Ｂ－１）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（Ｂ－２）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（Ｂ－３）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
【請求項７】
宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から前記発現させたＦｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項９】
不溶性担体と、当該担体に固定化した請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質とを含む、抗体吸着剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン（抗体）のＦｃ領域に対し結合親和性を有するＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。より詳しくは、従来のＦｃ結合性タンパク質と比較し、可溶性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。
続きを表示（約 2,300 文字）【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する受容体タンパク質であり、抗原と免疫グロブリンとの免疫複合体に結合して細胞内にシグナル伝達を行なう（非特許文献１）。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これにより免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まっている。
【０００３】
Ｆｃレセプターはさらにいくつかのサブタイプに分類でき、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプターをはじめ、Ｆｃαレセプター、Ｆｃεレセプター等が存在する。各レセプターはさらに細かく分類されており、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）のサブタイプに分類できる（非特許文献１および２）。
【０００４】
一方、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヒトＦｃγレセプターとは異なる、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連分子であり、重鎖（α鎖）とβ２ミクログロブリン（β鎖）により構成されている（非特許文献３）。ＦｃＲｎはＩｇＧのリサイクリング機構に関与しており、ＩｇＧの分解を抑制する働きをもつ。また、ＦｃＲｎはｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、ｐＨ６．５以下で結合する（非特許文献４）。
【０００５】
ヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ５５８９９）などの公的データベースに公表されている。また、β鎖のアミノ酸配列（配列番号２）も、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１７６９）に公表されている。さらに、ヒトＦｃＲｎの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃＲｎのα鎖の、図２にヒトＦｃＲｎのβ鎖の構造略図をそれぞれ示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍ）から２３番目のグリシン（Ｇ）までがシグナル配列（Ｓ）、２４番目のアラニン（Ａ）から２９７番目のセリン（Ｓ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２９８番目のバリン（Ｖ）から３２１番目のトリプトファン（Ｗ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および３２２番目のアルギニン（Ｒ）から３６５番目のアラニン（Ａ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。また、図２中のアミノ酸番号は配列番号２に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号２中の１番目のメチオニン（Ｍ）から２０番目のアラニン（Ａ）までがシグナル配列（Ｓ）、２１番目のイソロイシン（Ｉ）から１１９番目のメチオニン（Ｍ）までがβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とされている。
【０００６】
ＦｃＲｎを産業応用するためには、使用や保存などの観点から可溶性が高く、熱や酸に対して安定性が高いことが好ましい。安定性の高いＦｃＲｎは、特許文献１で、変異導入により天然型ヒトＦｃＲｎに対し、熱または酸に対する安定性が向上したＦｃＲｎを開示している。遺伝子工学的手法を用いたＦｃＲｎの発現は、非特許文献５で、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞を宿主として１０ｍｇ／Ｌの発現量で発現した例を開示している。しかし、動物細胞に比べて簡便で安価に製造可能な大腸菌を宿主としてＦｃＲｎを発現させようとした場合、当該ＦｃＲｎを可溶性の状態で大量に発現させることは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特開２０１８－１８３０８７号公報
【非特許文献】
【０００８】
ＴａｋａｉＴ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５
Ｊ．Ｇａｌｏｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７
Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１８４－１８７，１９８９
Ｍ．Ｒａｇｈａｖａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４６４９－１４６５７，１９９５
Ｙ．Ｆｅｎｇｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ．，７９（１），６６－７１，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、従来のヒトＦｃＲｎに対して可溶性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）α鎖の細胞外領域および二分子のヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域を連結した融合タンパク質とすることで、遺伝子工学的手法を用いて発現させる際、当該タンパク質の可溶性が従来のヒトＦｃＲｎよりも向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
（【００１１】以降は省略されています）

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