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公開番号2024153168
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-29
出願番号2023066893
出願日2023-04-17
発明の名称熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C12N 15/54 20060101AFI20241022BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素、当該逆転写酵素の製造方法、および当該逆転写酵素を含む核酸増幅試薬を提供すること。
【解決の手段】 AMV逆転写酵素を構成するアミノ酸のうち、特定の位置にあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、熱安定性が向上したAMV逆転写酵素を得ることができた。また前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、前記逆転写酵素を製造することができた。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＭＶ逆転写酵素；
配列番号１の７５１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じており、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記置換が残存したアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含み、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素。
続きを表示（約 320 文字）【請求項２】
請求項１に記載のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項５】
宿主が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記逆転写酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＡＭＶ逆転写酵素を含む、標的核酸の増幅試薬

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱に対する安定性を向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素に関する。
続きを表示（約 2,000 文字）【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性を有しているため、ｃＤＮＡ合成等に必要な遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬などに利用されている。ＡＭＶ逆転写酵素には、分子量約６３ｋＤａのα鎖および分子量約９５ｋＤａのβ鎖の２種類のサブユニットが知られているが、α鎖とβ鎖のヘテロ二量体（αβ体）は、α鎖のみの場合（α体）またはβ鎖のみの場合（β体）と比較して酵素活性が高く、これら試薬の成分として特に有用である（特許文献１）。
【０００３】
ＡＭＶ逆転写酵素の反応効率に影響を及ぼす要因のひとつに、ＲＮＡの二次構造があげられる。例えば、ＲＮＡ分子の塩基配列が分子内でハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、二本鎖ＲＮＡを形成する場合に、このような二次構造が形成されることがある。一般的に、ＲＮＡ分子を含む反応液の反応温度を上げることによって、ＲＮＡの二次構造の形成を減らし、反応効率を向上させることができる。反応温度の上昇はまた、プライマーのミスアニーリングやプライマーダイマー形成などに起因する非特異的な反応の進行の抑制にも効果的である。そのため、多くの場合、十分に高い温度（一例として、３７℃を超える温度）で反応を行なうことが望ましい。しかしながら、野生型ＡＭＶ逆転写酵素（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド）は熱に対する安定性が低く、ＲＮＡの二次構造形成や非特異的反応の進行が抑制されるような温度では、酵素活性を失うことがあった。
【０００４】
前記課題を解決すべく、α鎖にある特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素が知られている（特許文献２）。しかしながら、特許文献２で開示のＡＭＶ逆転写酵素におけるアミノ酸置換は、α体より酵素活性の高いαβ体では熱安定性向上の効果が報告されていない。またα鎖および／またはβ鎖にある特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで熱安定性が向上したαβ体またはβ体のＡＭＶ逆転写酵素も知られている（特許文献３）が、当該逆転写酵素におけるアミノ酸置換でも熱安定性の向上が不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
特開２００３－３３４０９５号公報
特開２０１３－１６５６６９号公報
特開２０１４－２０９８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素、当該逆転写酵素の製造方法、および当該逆転写酵素を含む核酸増幅試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討した結果、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を構成するアミノ酸残基のうち、特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定アミノ酸残基に置換することにより、熱に対する安定性が向上することを見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本願は以下の＜１＞から＜７＞に記載の態様を包含する：
＜１＞以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、ＡＭＶ逆転写酵素：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＭＶ逆転写酵素；
配列番号１の７５１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じており、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記置換が残存したアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含み、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素。
【０００９】
＜２＞＜１＞に記載のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
【００１０】
＜３＞＜２＞に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（【００１１】以降は省略されています）

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