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公開番号2025082807
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-29
出願番号2024157506
出願日2024-09-11
発明の名称遺伝子組換え大腸菌を用いたFc結合性タンパク質の製造方法
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類C12P 21/02 20060101AFI20250522BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】 Fc結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いて、効率的に製造する方法を提供すること。
【解決手段】 Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え大腸菌を培養し前記タンパク質を発現させる工程と、前記タンパク質を回収する工程とを含み、遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地がペプトンと酵母エキスとを少なくとも含む培地であり、かつ前記ペプトンの由来がダイズ、ワタ、ソラマメ、ルパン豆、トウモロコシ、ジャガイモ、エンドウ豆および大麦のいずれかである、方法でFc結合性タンパク質を製造することで前記課題を解決する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え大腸菌を培養し前記タンパク質を発現させる工程と、前記タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地がペプトンと酵母エキスとを少なくとも含む培地であり、かつ前記ペプトンの由来がダイズ、ワタ、ソラマメ、ルパン豆、トウモロコシ、ジャガイモ、エンドウ豆および大麦のいずれかである、前記製造方法。
続きを表示（約 2,600 文字）【請求項２】
遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地が糖類とリン酸塩とをさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｆｃ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｖｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１または２に記載の製造方法；
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（７）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号３の７１番目のシステインがアルギニンに置換
（２）配列番号３の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３）配列番号３の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換
（４）配列番号３の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（５）配列番号３の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換
（６）配列番号３の２７４番目のシステインがセリンに置換
（７）配列番号３の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換
（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において前記（１）から（７）に示すアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（７）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に示すアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（１）から（７）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｖｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（１０）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号３の７１番目のシステインがアルギニンに置換
（２）配列番号３の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３）配列番号３の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換
（４）配列番号３の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（５）配列番号３の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換
（６）配列番号３の２７４番目のシステインがセリンに置換
（７）配列番号３の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換
（８）配列番号３の８０番目のバリンがアスパラギン酸に置換
（９）配列番号３の９６番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１０）配列番号３の１７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換。
（ｖｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において前記（１）から（１０）に示すアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（１０）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｉｘ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（１０）に示すアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（１）から（１０）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いて、前記タンパク質を効率的に工業的製造する方法に関する。特に本発明はＦｃ結合性タンパク質がヒト新生児（ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）である場合に、特に効率的な製造方法に関する。
続きを表示（約 4,300 文字）【背景技術】
【０００２】
Ｆｃ結合性タンパク質（Ｆｃレセプター）は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する受容体タンパク質であり、抗原と免疫グロブリンとの免疫複合体に結合して細胞内にシグナル伝達を行なう（非特許文献１）。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これにより免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まっている。
【０００３】
Ｆｃレセプターはさらにいくつかのサブタイプに分類でき、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプターをはじめ、Ｆｃαレセプター、Ｆｃεレセプター等が存在する（非特許文献１および２）。その中でも、ヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヒトＦｃγレセプターとは異なる、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連分子であり、重鎖（α鎖）とβ２ミクログロブリン（β鎖）により構成されている（非特許文献３）。ＦｃＲｎはＩｇＧのリサイクリング機構に関与しており、ＩｇＧの分解を抑制する働きをもつ。また、ＦｃＲｎはｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、ｐＨ６．５以下で結合する（非特許文献４）。
【０００４】
このようなＦｃ結合性タンパク質が有する抗体の吸着能は、各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。そのため、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え体を利用した製造方法についてこれまでに検討されている。例えば遺伝子組換え大腸菌の培養により、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させる方法が開示されており、培養培地はペプトン等を含有する一般的なものを使用していた（非特許文献５）。しかし大腸菌培養培地に、培地成分として一般的に広く用いられているトリプトンを含有させると、所定のＦｃ結合性タンパク質の工業的生産が効率的に行なえないという課題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
ＴａｋａｉＴ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５
Ｊ．Ｇａｌｏｎｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７
Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１８４－１８７，１９８９
Ｍ．Ｒａｇｈａｖａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４６４９－１４６５７，１９９５
ＮｇＷｏｅｉＫｅａｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１２７，７３－８０，２０１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いて、前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題に対し、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養条件、および当該Ｆｃ結合性タンパク質の発現条件を鋭意検討した結果、本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
［１］Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え大腸菌を培養し前記タンパク質を発現させる工程と、前記タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法であって、
遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地がペプトンと酵母エキスとを少なくとも含む培地であり、かつ前記ペプトンの由来がダイズ、ワタ、ソラマメ、ルパン豆、トウモロコシ、ジャガイモ、エンドウ豆および大麦のいずれかである、前記製造方法。
【０００９】
［２］遺伝子組換え大腸菌の培養に用いる培地が糖類とリン酸塩とをさらに含む、前記［１］に記載の製造方法。
【００１０】
［３］Ｆｃ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｘ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記［１］または［２］に記載の製造方法；
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（７）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号３の７１番目のシステインがアルギニンに置換
（２）配列番号３の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３）配列番号３の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換
（４）配列番号３の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（５）配列番号３の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換
（６）配列番号３の２７４番目のシステインがセリンに置換
（７）配列番号３の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換
（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において前記（１）から（７）に示すアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（７）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（７）に示すアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（１）から（７）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｖｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の（１）から（１０）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号３の７１番目のシステインがアルギニンに置換
（２）配列番号３の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３）配列番号３の１９２番目のアルギニンがロイシンに置換
（４）配列番号３の１９６番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（５）配列番号３の２３２番目のグルタミンがロイシンに置換
（６）配列番号３の２７４番目のシステインがセリンに置換
（７）配列番号３の２９５番目のリジンがグルタミン酸に置換
（８）配列番号３の８０番目のバリンがアスパラギン酸に置換
（９）配列番号３の９６番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１０）配列番号３の１７２番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換。
（ｖｉｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において前記（１）から（１０）に示すアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（１０）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ｉｘ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列において、前記（１）から（１０）に示すアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記（１）から（１０）のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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