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公開番号2024082973
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-06-20
出願番号2022197217
出願日2022-12-09
発明の名称細菌叢を利用した薬剤耐性菌の定着リスクの検出方法
出願人国立大学法人富山大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12Q 1/68 20180101AFI20240613BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】細菌叢を利用して、薬剤耐性菌の定着リスクを検出すること。
【解決手段】被検体における薬剤耐性菌の定着リスクを検出する方法は、被検体から採取した糞便試料から、薬剤耐性菌の定着性と相関又は逆相関の関係がある1又は複数の細菌の核酸を定量すること、及び前記定量する工程で得られた核酸の量又はその増減から、薬剤耐性菌の定着リスクを判定することを含む方法。
【選択図】図9
特許請求の範囲【請求項１】
動物である被検体における薬剤耐性菌の定着リスクを検出する方法であって、
被検体から採取した糞便試料から、薬剤耐性菌の定着性と相関又は逆相関の関係にある１又は複数の細菌の核酸を定量すること、及び
前記定量する工程で得られた核酸の量又はその増減から、薬剤耐性菌の定着リスクを判定すること
を含む方法。
続きを表示（約 3,000 文字）【請求項２】
前記薬剤耐性菌の定着性と相関又は逆相関の関係にある１又は複数の細菌が、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤耐性菌の定着性と相関又は逆相関の関係にある１又は複数の細菌が、腸内細菌科の細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌の核酸の定量は、前記細菌のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）、２）、及び３）のポリヌクレオチドの等モル量混合物と、下記４）及び５）のポリヌクレオチドの等モル量混合物とからなるプライマーセットである、請求項４に記載の方法。
１）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号１の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
２）配列番号２の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号２の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号２の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
３）配列番号３の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号３の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
４）配列番号４の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号４の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
５）配列番号５の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号５の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）及び２）からなるプライマーセットである、請求項４に記載の方法。
１）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド、配列番号２の配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドの等モル量混合物
２）配列番号４の配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドの等モル量混合物
【請求項７】
前記判定することは、薬剤投与前の被検者の糞便試料中の核酸の量に比べて、薬剤投与期間中の被検者の糞便試料中の核酸の量が少ない場合に、被検体における薬剤耐性菌の定着リスクが上昇したと判定することを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記判定することは、薬剤投与期間中の被検者の糞便試料中の核酸の量に比べて、薬剤投与終了後の被検者の糞便試料中の核酸の量が多い場合に、被検体における薬剤耐性菌の定着リスクが低下したと判定することを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記判定することは、健常者の糞便試料中の核酸の平均量に比べて、被検者の糞便試料中の核酸の量が少ない場合に、被検体における薬剤耐性菌の定着リスクが高いと判定することを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）及び２）からなるプライマーセットである、請求項４に記載の方法。
１）配列番号６の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号６の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号６の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド
２）配列番号７の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号７の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号７の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌の定着リスクを検出する方法に関し、より詳細には、薬剤耐性菌が定着しやすい腸内細菌叢の特徴を利用した、薬剤耐性菌を保菌するリスクを評価するための方法に関する。
続きを表示（約 5,300 文字）【背景技術】
【０００２】
感染症を起こす細菌の中で、薬剤耐性化の進行が世界的な問題となっている。特に、基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（ESBL）産生菌やカルバペネマーゼ産生菌など、腸内環境に生息する細菌での急激な薬剤耐性の増加や、多様な耐性機序の存在が問題となっているが、現時点で有効な対策はない。その背景の一つとして、腸内環境が薬剤耐性菌を抱え込みやすくなっていることが考えられる。より具体的には、抗菌薬の使用などでもたらされる腸内細菌叢の乱れである“dysbiosis”が起きた場合に、薬剤耐性菌の定着や薬剤耐性遺伝子の菌種を超えた伝播を一層容易にしている可能性がある。
【０００３】
薬剤耐性菌の定着しやすさはdysbiosisだけに依存しているのではなく、細菌叢を構成する細菌群によっても影響されることが分かっている。発明者らは以前に、マウス薬剤耐性菌腸管定着モデルを用いて、16S rRNAメタゲノム解析で得られる細菌叢を比較し、薬剤耐性菌の定着しやすさと相関・逆相関の関係にある細菌群を線形判別分析（Linear Discriminant Analysis, LDA）で特定した。その結果、薬剤耐性菌の定着に抵抗的な細菌群として、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、バクテロイデス科（Bacteroidaceae）など、薬剤耐性菌の定着に許容的な細菌群として、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）などが特徴的に認められることを明らかにした（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
日本化学療法学会雑誌 68巻3号 Page 432(2020年5月)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
薬剤耐性菌の定着に至る前段階には、薬剤耐性菌が定着しやすいリスク状態が存在する。高リスク状態時に薬剤耐性菌が腸内環境へ実際に侵入することで薬剤耐性菌の定着に至るが、現在の医療では、薬剤耐性菌が定着した人への対応策はあるが、リスク状態にある人を見つけて対応するという策がなく、耐性菌保菌前のリスク評価法自体が欠如している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、細菌叢の特徴を利用して薬剤耐性菌の定着リスクを検出することを課題とする。
【０００７】
本発明は、以下に記載の実施形態を包含する。
項１．
動物である被検体における薬剤耐性菌の定着リスクを検出する方法であって、
被検体から採取した糞便試料から、薬剤耐性菌の定着性と相関又は逆相関の関係にある１又は複数の細菌の核酸を定量すること、及び
前記定量する工程で得られた核酸の量又はその増減から、薬剤耐性菌の定着リスクを判定すること
を含む方法。
項２．
前記薬剤耐性菌の定着性と相関又は逆相関の関係にある１又は複数の細菌が、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の細菌である項１に記載の方法。
項３．
前記薬剤耐性菌の定着性と逆相関の関係にある１又は複数の細菌が、腸内細菌科の細菌である項１に記載の方法。
項４．
前記細菌の核酸の定量は、前記細菌のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法により行われる、項１に記載の方法。
項５．
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）、２）、及び３）のポリヌクレオチドの等モル量混合物と、下記４）及び５）のポリヌクレオチドの等モル量混合物とからなるプライマーセットである、項４に記載の方法。
１）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号１の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
２）配列番号２の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号２の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号２の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
３）配列番号３の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号３の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
４）配列番号４の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号４の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
５）配列番号５の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号５の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、及びバクテロイデス科（Bacteroidaceae）の核酸を増幅するポリヌクレオチド
項６．
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）及び２）からなるプライマーセットである、項４に記載の方法。
１）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド、配列番号２の配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドの等モル量混合物
２）配列番号４の配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドの等モル量混合物
項７．
前記判定することは、薬剤投与前の被検者の糞便試料中の核酸の量に比べて、薬剤投与期間中の被検者の糞便試料中の核酸の量が少ない場合に、被検体における薬剤耐性菌の定着リスクが上昇したと判定することを含む、項５又は６に記載の方法。
項８．
前記判定することは、薬剤投与期間中の被検者の糞便試料中の核酸の量に比べて、薬剤投与終了後の被検者の糞便試料中の核酸の量が多い場合に、被検体における薬剤耐性菌の定着リスクが低下したと判定することを含む、項５又は６に記載の方法。
項９．
前記判定することは、健常者の糞便試料中の核酸の平均量に比べて、被検者の糞便試料中の核酸の量が少ない場合に、被検体における薬剤耐性菌の定着リスクが高いと判定することを含む、項５又は６に記載の方法。
項１０．
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）及び２）からなるプライマーセットである、項４に記載の方法。
１）配列番号６の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号６の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号６の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド
２）配列番号７の配列を含むポリヌクレオチド、
配列番号７の配列のうちの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド、又は
配列番号７の配列を含むポリヌクレオチドに対し、１又は２つの塩基が欠失、置換、又は付加されているポリヌクレオチドであって、腸内細菌科の核酸を増幅するポリヌクレオチド
項１１．
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の１）及び２）からなるプライマーセットである、項４に記載の方法。
１）配列番号６の配列を含むポリヌクレオチド
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、薬剤耐性菌が検出された後の対策だけでなく、保菌リスクを有する対象を評価することができる。
【０００９】
このため、薬剤耐性菌の温床とも言われる腸内環境へ、保菌前から対策を行うことにもつながり、耐性菌全体の問題を減少させられる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
LRB検出系のPCRに使用されるフォワードプライマー及びリバースプライマーの設計。
ETB検出系のPCRに使用されるフォワードプライマー及びリバースプライマーの設計。
抗菌薬なしの対照群（control群）、アンピシリン投与群（ABPC群）、メトロニタゾール投与群（MNZ群）の各々に薬剤耐性菌量（ESBL産生大腸菌）を接種した後の糞便中の薬剤耐性菌量とLRB菌量の経時的変化を示すグラフ。
抗菌薬なしの対照群（control群）、アンピシリン投与群（ABPC群）、メトロニタゾール投与群（MNZ群）の各々に薬剤耐性菌量（ESBL産生大腸菌）を接種した後の薬剤耐性菌量とETB菌量の経時的変化を示すグラフ。
(A)-(E) LRB検出系における5名の患者の抗菌薬投与によるC
T
値の変化を示すグラフ。図５(A)、(C)、及び(D)の細菌名は、抗菌薬投与後に各患者においてこれらの薬剤耐性菌の発育が確認されたことを示す。
(A)-(D) LRB検出系における4名の患者の抗菌薬投与期間中及び抗菌薬終了後のC
T
値の変化を示すグラフ。
LRB検出系を用いた薬剤耐性菌の定着リスクの評価。（A）各群のC
T
値。(B) C
T
値22で、各群の対象を分けた場合の円グラフ。
(A)-(D) ETB検出系における4名の患者の抗菌薬投与期間中及び抗菌薬終了後のC
T
値の変化を示すグラフ。
(A) 健常者、ESBL産生菌保菌者、及びESBL産生菌非保菌者の各群のLRB検出系におけるC
T
値のグラフ。（B）健常者、ESBL産生菌保菌者、及びESBL産生菌非保菌者の各群のETB検出系におけるC
T
値のグラフ。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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