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公開番号2024073420
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-29
出願番号2024019364,2020558973
出願日2024-02-13,2019-04-23
発明の名称DNAメチル化の標的化された編集によるSNCA発現の下方調節
出願人デュークユニバーシティ
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/09 20060101AFI20240522BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】SNCA発現の調節を標的化する新たな治療戦略の開発。
【解決手段】SNCA遺伝子のエピゲノム修飾用のClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9ベースのエピゲノム修飾剤組成物およびその使用方法が本明細書に開示される。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物であって、
（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ｉ）融合タンパク質または（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、および
（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列であって、前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、（ｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡまたは（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列
を含む組成物。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域を修飾する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ２、ＣｐＧ３、ＣｐＧ４、ＣｐＧ５、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１０、ＣｐＧ１１、ＣｐＧ１２、ＣｐＧ１３、ＣｐＧ１４、ＣｐＧ１５、ＣｐＧ１６、ＣｐＧ１７、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、ＣｐＧ２３、またはその組合せを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域が、ＣｐＧ１、ＣｐＧ３、ＣｐＧ６、ＣｐＧ７、ＣｐＧ８、ＣｐＧ９、ＣｐＧ１８、ＣｐＧ１９、ＣｐＧ２０、ＣｐＧ２１、ＣｐＧ２２、またはその組合せを含む、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドドメインが、メチラーゼ活性を有するペプチドを含み、かつ、前記融合タンパク質が、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン１内の少なくとも１つのＣｐＧアイランド領域をメチル化する、請求項３～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、その相補体、そのバリアント、またはその組合せのうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、前記ＳＮＣＡ遺伝子のイントロン４内の標的領域に前記融合タンパク質を標的化し、かつ、イントロン４内の前記標的領域が、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１および／またはＨ３Ｋ２７Ａｃマークであってもよい、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２のポリペプチドドメインが、ＤＮＡ（シトシン－５）－メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３Ａ）、その機能的断片、および／またはそのバリアントを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が前記ＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２３日に出願された米国仮出願第６２／６６１，１３４号、２０１８年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／６７６，１４９号、２０１９年１月８日に出願された米国仮出願第６２／７８９，９３２号、および２０１９年３月２６日に出願された米国仮出願第６２／８２４，１９５号の優先権を主張し、これらの各仮出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の利益の声明
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｏｒｄｅｒｓ＆Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ）により授与された連邦助成金番号ＮＳ０８５０１１の下での政府の支援により為された。米国政府は本発明に対してある特定の権利を有する。
技術分野
本開示は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用のＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）９ベースのエピゲノム修飾剤組成物およびその使用方法を対象とする。
続きを表示（約 4,200 文字）【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は世界において２番目に一般的な神経変性障害である。ＰＤを予防しまたはその進行を停止させる効果的な治療はない。ＳＮＣＡ遺伝子は、ＰＤの高度に有意な遺伝学的リスク因子として関係付けられてきた。追加的に、蓄積しつつある証拠は、野生型α－シヌクレインのレベルの上昇はＰＤの病理発生の原因となることを示唆する。現在までに、ＳＮＣＡ遺伝子によりコードされるα－シヌクレインは、ＰＤの最も検証され、有望な治療標的の１つである。さらに、ＳＮＣＡレベルのマニピュレーションは有益な影響力を実証している。しかしながら、ＳＮＣＡレベルの堅牢な低減と関連付けられる神経毒性が、ＳＮＣＡ転写物を直接的に標的化するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ツールを利用する研究で報告された。そのため、α－シヌクレインの正常な生理学的レベルを維持することを可能とするＳＮＣＡ転写の緊密な調節を達成するための標的の同定および検証が必要とされる。
【０００３】
遺伝子およびエピジェネティック調節を含む、いくつかの調節機構がＳＮＣＡ発現レベルに寄与する。ＤＮＡメチル化は転写調節における重要な機構であり、ＳＮＣＡ発現の増加は、ＳＮＣＡイントロン１におけるＣｐＧの脱メチル化と同時発生的であり得る。さらには、研究は、ＳＮＣＡイントロン１の疾患に関連する差次的なＤＮＡメチル化を示している。ＰＤ患者からの死後の脳組織および血液の分析は、対照ドナーと比較してＳＮＣＡイントロン１におけるより低いメチル化レベルを実証した。ＳＮＣＡ－ｍＲＮＡ発現の上昇と相関したＳＮＣＡイントロン１におけるＤＮＡメチル化の変化もまた、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）患者において報告されている。ＤＮＡメチル化は、ＳＮＣＡ遺伝子発現のマニピュレーションのための魅力的なアプローチである。さらに、ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現に対する長期効果の可能性を有する安定なエピジェネティックマークを表す。
【０００４】
α－シヌクレイン発現レベルを特異的に標的化することは魅力的な神経保護戦略であり、ＳＮＣＡレベルのマニピュレーションは有益な効果を実証している。ＳＮＣＡレベルをマニピュレートするための１つのアプローチはｓｉＲＮＡによるものである。しかしながら、ＲＮＡｉアプローチは２つの顕著な短所を有する。第１に、ＲＮＡｉは、「生理学的」レベルのＳＮＣＡ発現を達成するために緊密調節が所望されるノックダウンのために精密な分解能を提供しない。例えば、ＳＮＣＡ－ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを有するＡＡＶベクターは、ラットモデルにおいてＳＮＣＡレベルの堅牢な低減の結果として、高レベルの毒性を示し、黒質線条体ドパミン作動性ニューロンの有意な損失を引き起こした。これと一致して、ＭＮ９Ｄ細胞におけるＳＮＣＡの下方調節は細胞生存能力を減少させた。第２に、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の全ゲノム発現プロファイリングにより実証されるように、ＲＮＡｉは、その意図する標的以外の遺伝子の発現に影響することがある。一方でＰＤ病理発生においてＳＮＣＡ過剰発現が役割を担い、他方でα－シヌクレインタンパク質の正常な生理学的レベルを維持する必要性があることは、ＳＮＣＡ発現の調節機構を標的化する新たな治療戦略を開発するこれまで満たされていない必要性を強調する。そのため、ＳＮＣＡ発現の調節を標的化する新たな治療戦略を開発する満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＳＮＣＡ遺伝子のエピゲノム修飾用の組成物を対象とする。組成物は、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはその組合せからなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、および（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列であって、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡまたは（ｂ）（ｉｉ）少なくとも１つのガイドｇＲＮＡをコードする核酸配列を含む。
本発明は、前記組成物をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。
本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
本発明は、少なくとも１つの前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記宿主細胞、またはその組合せを含む医薬組成物を対象とする。
本発明は、前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、またはその組合せのうちの少なくとも１つを含むキットを対象とする。
【０００６】
本発明は、細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎｖｉｖｏモジュレーションの方法を対象とする。方法は、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量の前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つと細胞を接触させることを含む。
【０００７】
本発明はまた、対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現のｉｎｖｉｖｏモジュレーションの方法を対象とする。方法は、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量の前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つと対象を接触させることを含む。
【０００８】
本発明は、対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を対象とする。方法は、前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを対象に投与することを含む。方法は、前記組成物、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、前記医薬組成物、またはその組合せのうちの少なくとも１つを対象中の細胞に投与することを含んでもよい。
【０００９】
本発明は、細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎｖｉｖｏでモジュレートする方法を対象とする。本発明は、対象中の細胞におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎｖｉｖｏでモジュレートする方法を対象とする。本発明は、対象におけるＳＮＣＡ遺伝子の発現をｉｎｖｉｖｏでモジュレートする方法を対象とする。方法は、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合タンパク質を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で細胞または対象と接触させることを含む。
【００１０】
本発明は、対象においてＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を対象とする。本発明はまた、対象中の細胞におけるＳＮＣＡ発現レベルの上昇と関連付けられる疾患または障害を治療する方法を対象とする。方法は、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が２つの異種ポリペプチドドメインを含み、第１のポリペプチドドメインがＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ、第２のポリペプチドドメインが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、およびデアセチラーゼ活性からなる群から選択される活性を有するペプチドを含む、（ａ）（ｉ）融合タンパク質または（ａ）（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または（ｂ）（ｉｉ）ＳＮＣＡ遺伝子内の標的領域に融合分子を標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を、遺伝子の発現をモジュレートするために十分な量で対象または対象中の細胞に投与することを含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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