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公開番号2023166579
公報種別公開特許公報(A)
公開日2023-11-21
出願番号2023150987,2019561258
出願日2023-09-19,2018-05-07
発明の名称遺伝子操作されたリガーゼバリアント
出願人コデクシス, インコーポレイテッド
代理人個人,個人
主分類C12N 15/52 20060101AFI20231114BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】遺伝子操作されたリガーゼバリアントを提供すること。
【解決手段】本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を、診断およびその他の目的のために使用する方法を提供する。本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも1種のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年５月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５０３，０７５号、２０１７年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４０，７３４号および２０１７年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，０３０号に対する優先権の利益を主張し、そのそれぞれは、本明細書に全ての目的のために参照により援用される。
配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
続きを表示（約 8,300 文字）【０００２】
ファイル名ＣＸ９－１６０ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介してコンピュータで読み取り可能な形態（ＣＲＦ）で３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下、本明細書と同時に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、１００キロバイトのファイルの大きさで、２０１８年５月７日に作製された。
【０００３】
本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を、診断およびその他の目的のために使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡリガーゼは、隣接する３’－ヒドロキシル末端および５’－リン酸末端の縮合による、核酸分子における新規ホスホジエステル結合の形成を触媒する。酵素は、平滑末端および付着「粘着」末端を結合し、二本鎖ＤＮＡおよび一部のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中の一本鎖ニックも修復する。使用される種々のリガーゼがあり、そのうちの１種がバクテリオファージＴ４由来のＤＮＡリガーゼである。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、バイオテクノロジーにおいて最も広く使用される酵素のうちの１種である。用途が見出されている種々のＤＮＡリガーゼがあるが、当技術分野では、診断および研究目的のための改善されたリガーゼが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドおよびその組成物ならびに遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断およびその他の目的のために遺伝子操作されたリガーゼポリペプチドを含む組成物を使用する方法を提供する。
【０００６】
本発明は、配列番号２、６、３２、３４および／または３８の参照配列もしくはその機能的断片に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む遺伝子操作されたリガーゼを提供し、遺伝子操作されたリガーゼは、そのポリペプチド配列中に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２、６、３２、３４または３８に関して番号付けされている。
【０００７】
本発明はまた、少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼを提供し、少なくとも１つの置換または置換セットは、５２／５６／４０４、５２／５６／４０４／４１２、１２７／２０７、１２７／２１３、１２７／２１３／２７６／３３９、１４０／１８１／２３４、１６５／１８１／２９９、１６５／１８１／２８１／２９９、２３８／２４１／４０４／４１２／４６２および４６２ならびに／またはそれらの任意の組合せから選択され、アミノ酸位置は、配列番号２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、５２Ｅ／５６Ｒ／４０４Ｋ、５２Ｅ／５６Ｖ／４０４Ｋ／４１２Ｔ、１２７Ｋ／２０７Ｒ、１２７Ｋ／２１３Ｍ、１２７Ｋ／２１３Ｍ／２７６Ｇ／３３９Ｖ、１４０Ａ／１８１Ｔ／２３４Ｍ、１６５Ａ／１８１Ｔ／２９９Ｐ、１６５Ａ／１８１Ｔ／２８１Ａ／２９９Ａ、２３８Ｌ／２４１Ｌ／４０４Ｋ／４１２Ｔ／４６２Ｋおよび４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２に関して番号付けされている。いくつかのさらなる実施形態では、置換または置換セットは、Ｋ５２Ｅ／Ａ５６Ｒ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ａ５６Ｖ／Ｎ４０４Ｋ／Ｋ４１２Ｔ、Ｐ１２７Ｋ／Ｉ２０７Ｒ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２１３Ｍ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２１３Ｍ／Ｃ２７６Ｇ／Ｉ３３９Ｖ、Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｌ２３４Ｍ、Ｃ１６５Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｋ２９９Ｐ、Ｃ１６５Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｖ２８１Ａ／Ｋ２９９Ａ、Ｙ２３８Ｌ／Ｎ２４１Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｋ４１２Ｔ／Ｉ４６２ＫおよびＩ４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号２に関して番号付けされている。
【０００８】
本発明は、５２／１２７／１４０／１８１／４６２、５２／１２７／１４０／１８１／２３８、５２／１２７／１８１／４６２、５２／１２７／２７６／３７２／４６２、５２／１２７／４０４、５２／１４０／１８１／２３８／２７６／２９３／４０４、５２／１４０／１８１／２７６／２９９／４０４／４６２、５２／１４０／２０７／２９９／３７２／４０４／４６２、５２／１４０／２３８／２７６／２９９／３７２／４０４、５２／１８１、５２／１８１／２３８／２７６、５２／１８１／２３８／２９９／４０４、５２／１８１／２９３、５２／２０７／２３８／２９３／２９９／４０４／４６２、５２／２７６／２９９／４０４、５２／２３８／４０４／４６２、５２／２９３／２９９／４０４／４６２、５２／４０４／４６２、５８／６３／８９、５８／８８／８９／２２６／４４０、５８／８８／１９９／２２５／２２６、５８／８８／２２６／３０６、５８／８８／３０６／４７０、５８／４４０／４７０、５８／４５１、６３／８８／８９、６３／８８／４５１、６３／８９／２２６／４４０／４５１、６３／８９／４５１、６３／１９９／２９７／３７５、８８／２２５／４４０／４５１、８８／３０６／４４０／４５１、８８／４７０、８９、１２７、１２７／１４０／２３８、１２７／１４０／２７６、１２７／１４０／２９９／３７２／４６２、１２７／１８１／２０７、１２７／１８１／２３８／３７２、１２７／１８１／２７６、１２７／１８１／４０４、１２７／２０７／２３８／３７２、１２７／２３８／２９３／４６２、１２７／２３８／２９３／２９９／３７２／４０４、１２７／２３８／２９３／２９９／４０４、１２７／２３８／３７２／４６２、１２７／２９３、１２７／２９３／３７２／４６２、１２７／２９３／４０４／４６２、１２７／４６２、１４０／２３８／３７２／４６２、１４０／２７６／２９３／４０４、１４０／２８５／２９３／４０４、１４０／２９９／３７２／４０４／４６２、１４０／３７２、１４０，１８１／２０７／２３８、１８１／２０７／２３８／２７６／２９３／３７２／４０４、１８１／２０７／２３８／３７２、１８１／２３８／２７６、１８１／２３８／２９９／４０４、１８１，／２３８／４６２、１８１／２７６、１８１／２９３、１８１／４６２、２３８／２９３／２９９／３７２／４６２、２３８／２９３／３７２、２３８／２９９／４０４、２３８／４０４／４６２、２７６／２９３／４６２、２７６／４０４、２９３／３７２、２９９／３７２／４６２、２９９／４０４／４６２、３７２、３７２／４６２、４０４、４５１、および４６２ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、２Ｅ／１２７Ｋ／１４０Ａ／１８１Ｔ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１２７Ｋ／１４０Ａ／１８１Ｔ／２３８Ｌ、５２Ｅ／１２７Ｋ／１８１Ｔ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１２７Ｋ／２７６Ｇ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１２７Ｋ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／２７６Ｇ／２９３Ｅ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／１８１Ｔ／２７６Ｇ／２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／２０７Ｒ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／１４０Ａ／２３８Ｌ／２７６Ｇ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１８１Ｔ、５２Ｅ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／２７６Ｇ、５２Ｅ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、５２Ｅ／１８１Ｔ／２９３Ｅ、５２Ｅ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／２７６Ｇ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、５２Ｅ／２３８Ｌ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５２Ｅ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、５８Ｋ／６３Ｒ／８９Ｋ、５８Ｋ／８８Ｒ／８９Ｋ／２２６Ｅ／４４０Ｋ、５８Ｋ／８８Ｒ／１９９Ｅ／２２５Ａ／２２６Ｅ、５８Ｋ／８８Ｒ／２２６Ｅ／３０６Ａ、５８Ｋ／８８Ｒ／３０６Ａ／４７０Ｅ、５８Ｋ／４４０Ｋ／４７０Ｅ、５８Ｋ／４５１Ｋ、６３Ｒ／８８Ｒ／８９Ｋ、６３Ｒ／８８Ｒ／４５１Ｋ、６３Ｒ／８９Ｋ／２２６Ｅ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、６３Ｒ／８９Ｋ／４５１Ｋ、６３Ｒ／１９９Ｅ／２９７Ｇ／３７５Ｅ、８８Ｒ／２２５Ａ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、８８Ｒ／３０６Ａ／４４０Ｋ／４５１Ｋ、８８Ｒ／４７０Ｅ、８９Ｋ、１２７Ｋ、１２７Ｋ／１４０Ａ／２３８Ｌ、１２７Ｋ／１４０Ａ／２７６Ｇ、１２７Ｋ／１４０Ａ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／２０７Ｒ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／２３８Ｌ／３７２Ｉ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／２７６Ｇ、１２７Ｋ／１８１Ｔ／４０４Ｋ、１２７Ｋ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／３７２Ｉ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、１２７Ｋ／２３８Ｌ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／２９３Ｅ、１２７Ｋ／２９３Ｅ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／２９３Ｅ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、１２７Ｋ／４６２Ｋ、１４０Ａ／２３８Ｌ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、１４０Ａ／２７６Ｇ／２９３Ｅ／４０４Ｋ、１４０Ａ／２８５Ａ／２９３Ｅ／４０４Ｋ、１４０Ａ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、１４０Ａ／３７２Ｉ、１４０Ｔ、１８１Ｔ／２０７Ｒ／２３８Ｌ、１８１Ｔ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／２７６Ｇ／２９３Ｅ／３７２Ｉ／４０４Ｋ、１８１Ｔ／２０７Ｒ／２３８Ｌ／３７２Ｉ、１８１Ｔ／２３８Ｌ／２７６Ｇ、１８１Ｔ／２３８Ｌ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、１８１Ｔ／２３８Ｌ／４６２Ｋ、１８１Ｔ／２７６Ｇ、１８１Ｔ／２９３Ｅ、１８１Ｔ／４６２Ｋ、２３８Ｌ／２９３Ｅ／２９９Ｐ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、２３８Ｌ／２９３Ｅ／３７２Ｉ、２３８Ｌ／２９９Ｐ／４０４Ｋ、２３８Ｌ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、２７６Ｇ／２９３Ｅ／４６２Ｋ、２７６Ｇ／４０４Ｋ、２９３Ｅ／３７２Ｉ、２９９Ｐ／３７２Ｉ／４６２Ｋ、２９９Ｐ／４０４Ｋ／４６２Ｋ、３７２Ｉ、３７２Ｉ／４６２Ｋ、４０４Ｋ、４５１Ｋ、および４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｃ２７６Ｇ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｐ１２７Ｋ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｓ１８１Ｔ／Ｃ２７６Ｇ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｉ２０７Ｒ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１４０Ａ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｓ１８１Ｔ／Ｌ２９３Ｅ、Ｋ５２Ｅ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｃ２７６Ｇ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｙ２３８Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ５２Ｅ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｑ５８Ｋ／Ｌ６３Ｒ／Ｅ８９Ｋ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｋ２２６Ｅ／Ｅ４４０Ｋ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ２２５Ａ／Ｋ２２６Ｅ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｋ２２６Ｅ／Ｋ３０６Ａ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ８８Ｒ／Ｋ３０６Ａ／Ｋ４７０Ｅ、Ｑ５８Ｋ／Ｅ４４０Ｋ／Ｋ４７０Ｅ、Ｑ５８Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８８Ｒ／Ｅ８９Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８８Ｒ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｋ２２６Ｅ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｅ８９Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｌ６３Ｒ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９７Ｇ／Ｋ３７５Ｅ、Ｅ８８Ｒ／Ｋ２２５Ａ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｅ８８Ｒ／Ｋ３０６Ａ／Ｅ４４０Ｋ／Ｔ４５１Ｋ、Ｅ８８Ｒ／Ｋ４７０Ｅ、Ｅ８９Ｋ、Ｐ１２７Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｙ２３８Ｌ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｃ２７６Ｇ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１４０Ａ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｃ２７６Ｇ、Ｐ１２７Ｋ／Ｓ１８１Ｔ／Ｎ４０４Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２９３Ｅ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｖ２８５Ａ／Ｌ２９３Ｅ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１４０Ａ／Ｖ３７２Ｉ、Ｓ１４０Ｔ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ２０７Ｒ／Ｙ２３８Ｌ／Ｖ３７２Ｉ、Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｃ２７６Ｇ、Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｓ１８１Ｔ／Ｙ２３８Ｌ／Ｉ４６２Ｋ、Ｓ１８１Ｔ／Ｃ２７６Ｇ、Ｓ１８１Ｔ／Ｌ２９３Ｅ、Ｓ１８１Ｔ／Ｉ４６２Ｋ、Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ、Ｙ２３８Ｌ／Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ、Ｙ２３８Ｌ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｃ２７６Ｇ／Ｌ２９３Ｅ／Ｉ４６２Ｋ、Ｃ２７６Ｇ／Ｎ４０４Ｋ、Ｌ２９３Ｅ／Ｖ３７２Ｉ、Ｋ２９９Ｐ／Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｋ２９９Ｐ／Ｎ４０４Ｋ／Ｉ４６２Ｋ、Ｖ３７２Ｉ、Ｖ３７２Ｉ／Ｉ４６２Ｋ、Ｎ４０４Ｋ、Ｔ４５１Ｋ、およびＩ４６２Ｋから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号６に関して番号付けされている。
【０００９】
本発明は、１９、１９／１２７／１９９、１９／１２７／３０６、１９／２３８、８９、８９／１２７、８９／１２７／２３８／３０６、１２７、１２７／１３３／２３８／３７５、１２７／１７７／２３８／２９３／３０６、１２７／２３８、１２７／３０６、１２７／３８５、１７６／２４４／２４７／３７３／４３８、１７６／２５０／３７３／４３８／４８０、２３８、２３８／３０６／３７２、２４４、２４４／２４７、２４４／２４７／２５０、２４４／２５０／４３８、２４４／４３８、２４７／３７３／４２７／４３８、２９７、３０６、３７２、４０４、および４３８ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、１９Ｋ、１９Ｋ／１２７Ｋ／１９９Ｓ、１９Ｋ／１２７Ｋ／３０６Ａ、１９Ｋ／２３８Ｌ、８９Ｋ、８９Ｋ／１２７Ｋ、８９Ｋ／１２７Ｋ／２３８Ｌ／３０６Ａ、１２７Ｋ、１２７Ｋ／１３３Ｈ／２３８Ｌ／３７５Ｒ、１２７Ｋ／１７７Ａ／２３８Ｌ／２９３Ｐ／３０６Ａ、１２７Ｋ／２３８Ｌ、１２７Ｋ／３０６Ａ、１２７Ｋ／３８５Ｅ、１７６Ｇ／２４４Ｓ／２４７Ｋ／３７３Ａ／４３８Ｄ、１７６Ｇ／２５０Ｓ／３７３Ａ／４３８Ｄ／４８０Ｓ、２３８Ｌ、２３８Ｌ／３０６Ａ／３７２Ｉ、２４４Ｓ、２４４Ｓ／２４７Ｋ、２４４Ｓ／２４７Ｋ／２５０Ｓ、２４４Ｓ／２５０Ｓ／４３８Ｄ、２４４Ｓ／４３８Ｄ、２４７Ｋ／３７３Ａ／４２７Ｋ／４３８Ｄ、２９７Ｓ、３０６Ａ、３７２Ｉ、４０４Ｋ、および４３８Ｄから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｑ１９Ｋ、Ｑ１９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ１９９Ｓ、Ｑ１９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｋ３０６Ａ、Ｑ１９Ｋ／Ｙ２３８Ｌ、Ｅ８９Ｋ、Ｅ８９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ、Ｅ８９Ｋ／Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ３０６Ａ、Ｐ１２７Ｋ、Ｐ１２７Ｋ／Ｑ１３３Ｈ／Ｙ２３８Ｌ／Ｋ３７５Ｒ、Ｐ１２７Ｋ／Ｖ１７７Ａ／Ｙ２３８Ｌ／Ｌ２９３Ｐ／Ｋ３０６Ａ、Ｐ１２７Ｋ／Ｙ２３８Ｌ、Ｐ１２７Ｋ／Ｋ３０６Ａ、Ｐ１２７Ｋ／Ｄ３８５Ｅ、Ｄ１７６Ｇ／Ａ２４４Ｓ／Ｆ２４７Ｋ／Ｄ３７３Ａ／Ｅ４３８Ｄ、Ｄ１７６Ｇ／Ｖ２５０Ｓ／Ｄ３７３Ａ／Ｅ４３８Ｄ／Ｄ４８０Ｓ、Ｙ２３８Ｌ、Ｙ２３８Ｌ／Ｋ３０６Ａ／Ｖ３７２Ｉ、Ａ２４４Ｓ、Ａ２４４Ｓ／Ｆ２４７Ｋ、Ａ２４４Ｓ／Ｆ２４７Ｋ／Ｖ２５０Ｓ、Ａ２４４Ｓ／Ｖ２５０Ｓ／Ｅ４３８Ｄ、Ａ２４４Ｓ／Ｅ４３８Ｄ、Ｆ２４７Ｋ／Ｄ３７３Ａ／Ｅ４２７Ｋ／Ｅ４３８Ｄ、Ｒ２９７Ｓ、Ｋ３０６Ａ、Ｖ３７２Ｉ、Ｎ４０４Ｋ、およびＥ４３８Ｄから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。
【００１０】
本発明は、５１、５６、６０、６３、８６、１４９、１７４、１８４、１９９、２０７、２３３、２３７、２３８、２４０、３１４、３２９、３７１、３７３、３８５、４２７、４３８、４３９、４４６、４４８、４５１、４５２、４５３、４５４、４６１、４６６、４７６、および４８５ならびに／もしくはそれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置での置換（複数可）を含む少なくとも１つの置換または置換セットを含む遺伝子操作されたリガーゼをさらに提供し、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、５１Ｒ、５６Ｓ、６０Ｇ／Ｖ、６３Ｔ、８６Ｒ、１４９Ｒ、１７４Ｐ、１８４Ａ、１９９Ｔ、２０７Ｑ／Ｖ、２３３Ａ／Ｔ、２３７Ｎ／Ｒ、２３８Ｌ、２４０Ｐ、３１４Ｖ、３２９Ｇ／Ｌ、３７１Ｖ／Ｗ、３７３Ａ／Ｇ、３８５Ａ／Ｗ、４２７Ｌ／Ｒ、４３８Ｄ／Ｆ／Ｇ、４３９Ｓ、４４６Ｒ、４４８Ａ／Ｇ／Ｐ、４５１Ｇ、４５２Ｐ／Ｖ、４５３Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、４５４Ｌ、４６１Ｃ、４６６Ｇ／Ｐ、４７６Ａ、および４８５Ｇ／Ｙから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。いくつかの追加の実施形態では、置換（複数可）または置換セットは、Ｐ５１Ｒ、Ａ５６Ｓ、Ｆ６０Ｇ／Ｖ、Ｌ６３Ｔ、Ａ８６Ｒ、Ｎ１４９Ｒ、Ｌ１７４Ｐ、Ｇ１８４Ａ、Ｋ１９９Ｔ、Ｉ２０７Ｑ／Ｖ、Ｆ２３３Ａ／Ｔ、Ａ２３７Ｎ／Ｒ、Ｙ２３８Ｌ、Ｅ２４０Ｐ、Ｙ３１４Ｖ、Ｄ３２９Ｇ／Ｌ、Ｄ３７１Ｖ／Ｗ、Ｄ３７３Ａ／Ｇ、Ｄ３８５Ａ／Ｗ、Ｅ４２７Ｌ／Ｒ、Ｅ４３８Ｄ／Ｆ／Ｇ、Ｃ４３９Ｓ、Ｋ４４６Ｒ、Ｄ４４８Ａ／Ｇ／Ｐ、Ｋ４５１Ｇ、Ｄ４５２Ｐ／Ｖ、Ｙ４５３Ｇ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｖ４５４Ｌ、Ａ４６１Ｃ、Ｅ４６６Ｇ／Ｐ、Ｄ４７６Ａ、およびＴ４８５Ｇ／Ｙから選択される置換または置換セットを含み、アミノ酸位置は、配列番号３２に関して番号付けされている。
（【００１１】以降は省略されています）

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