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公開番号2025084859
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-03
出願番号2025030152,2022073409
出願日2025-02-27,2017-12-21
発明の名称可逆的透過処理によるベクターフリー細胞内送達法
出願人アヴェクタスリミテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/87 20060101AFI20250527BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】非接着細胞などの浮遊細胞のトランスフェクションを容易にするための組成物および方法を提供する。
【解決手段】非接着細胞の集団を提供する工程、および該細胞の集団をある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、該水溶液がペイロードと濃度5%(v/v)超のアルコールとを含む、工程を含む、非接着細胞の形質膜を横切って該ペイロードを送達する方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
非接着細胞の集団を提供する工程、および
該細胞の集団をある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、該水溶液がペイロードと濃度5％（v/v）超のアルコールとを含む、工程
を含む、非接着細胞の形質膜を横切って該ペイロードを送達する方法。
続きを表示（約 430 文字）【請求項２】
前記アルコールがエタノールを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液が10％超のエタノールを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液が20～30％のエタノールを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液が27％のエタノールを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液が12.5～500mMのKClを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶液が106mMのKClを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記非接着細胞が末梢血単核細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記非接着細胞が免疫細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記非接着細胞がTリンパ球を含む、請求項1に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第119条の下で、2016年12月22日に出願された米国仮特許出願第62/438,298号、2017年7月5日に出願された米国仮特許出願第62/528,963号、および2017年7月25日に出願された米国仮特許出願第62/536,831号に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願のそれぞれは参照により本明細書に明確に組み入れられる。
続きを表示（約 1,900 文字）【０００２】
発明の分野
本発明は哺乳動物細胞内への作用物質の送達に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
異なる細胞タイプ間では細胞トランスフェクション効率にばらつきが存在する。非接着細胞などの浮遊細胞のトランスフェクションは、従来の方法では、非常に困難であることがわかっている。したがって、そのような細胞のトランスフェクションを容易にするための組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、非接着細胞中にペイロード/カーゴ化合物および組成物を送達するという課題に対する解決策を提供する。したがって、非接着細胞の形質膜を横切ってペイロードを送達する方法は、非接着細胞の集団を提供する工程、および、該細胞の集団をある体積の等張水溶液と接触させる工程であって、該水溶液がペイロードと濃度5％（v/v）超のアルコールとを含む、工程を含む。例えばアルコールはエタノール、例えば10％超のエタノールを含む。いくつかの例において、水溶液は20～30％のエタノール、例えば27％のエタノールを含む。
【０００５】
細胞にカーゴを送達するための水溶液は、塩、例えば12.5～500mMの塩化カリウム（KCl）を含む。例えば溶液は、ヒトT細胞などの哺乳動物細胞の細胞質に対して等張である。そのような等張送達溶液の一例は106mMのKClである。
【０００６】
本方法は、1種類または複数種類の任意のカーゴ分子を、接着性または非接着性の哺乳動物細胞に送達するために使用することができ、非接着細胞へのカーゴの送達には特に有用である。なぜなら、本発明以前は、そうすることに困難が伴ったからである。いくつかの例において、非接着細胞は末梢血単核細胞を含み、例えば非接着細胞はT細胞（Tリンパ球）などの免疫細胞を含む。T細胞などの免疫細胞は、CD3のリガンド、CD28のリガンド、またはそれらの組合せによって任意で活性化される。例えばリガンドは、CD3もしくはCD28またはその両方に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０００７】
本方法では、単層を構成する非接着細胞の集団に、送達溶液中のカーゴが送達される。例えば単層を水性送達溶液のスプレーと接触させる。本方法はペイロード/カーゴ（化合物または組成物）を細胞の細胞質中に送達し、ここで、細胞の集団が、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションによるペイロードの送達と比較して、より大きい生存百分率を成す。これはソルポレーション（Soluporation）システムの大きな利点である。
【０００８】
任意の化合物または組成物を送達することができる。例えばペイロードはメッセンジャーリボ核酸（mRNA）、例えば遺伝子編集組成物をコードするmRNAを含む。例えば遺伝子編集組成物はPD-1またはPD-L1などの免疫チェックポイント阻害因子の発現を低減する。いくつかの例において、mRNAはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする。
【０００９】
ある特定の態様において、非接着/浮遊細胞の単層はメンブレンフィルター上に存在する。いくつかの態様では、細胞単層を送達溶液のスプレーと接触させた後に、メンブレンフィルターを振動させる。メンブレンフィルターは、細胞への送達溶液のスプレー前、スプレー中、および/またはスプレー後に、振動または動揺させうる。
【００１０】
ウェルを含むプレートを受容するように構成された筐体、ウェルに圧力差を適用するように構成された圧力差適用装置、微粒化された送達溶液をウェルに送達するように構成された送達溶液適用装置、停止溶液をウェルに送達するように構成された停止溶液適用装置、および培養用培地をウェルに送達するように構成された培養用培地適用装置を備える、システムも本発明に包含される。停止溶液は細胞膜透過処理剤、例えばエタノールを欠くものである。一例は、リン酸緩衝食塩水または生理学的に適合する任意の緩衝溶液である。本システムは、圧力差をウェルに適用するための圧力差適用装置をウェルに隣接して整列させるように、微粒化された送達溶液をウェルに送達するための送達溶液適用装置をウェルに隣接して整列させるように、停止溶液をウェルに送達するための停止溶液適用装置をウェルに隣接して整列させるように、かつ/または培養用培地をウェルに送達するための培養用培地適用装置をウェルに隣接して整列させるように構成された、アドレス指定可能ウェルアセンブリを任意でさらに備える。
（【００１１】以降は省略されています）

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