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公開番号2025072608
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2025020820,2021520118
出願日2025-02-12,2019-10-11
発明の名称細胞培養のための組成物および方法
出願人ザユナイテッドステイツオブアメリカアズリプリゼンテッドバイザセクレタリー、デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシーズ,THE U.S.A.AS REPRESENTED BY THE SECRETARY,DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/07 20100101AFI20250430BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】哺乳類細胞、組織および/または器官の培養に有用な組成物および方法を提供する。
【解決手段】本組成物はクロマン1またはその誘導体を含み、エミリカサンまたはその誘導体をさらに含み得、トランス-ISRIBおよびポリアミンのうちの1つまたは両方をさらに含み得る。本組成物は、培地添加剤、培地濃縮物または作業培地として配合され得る。本組成物および方法は、幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、または遺伝的に改変された細胞を含む改変細胞の培養に使用され得る。本組成物および方法は、細胞、組織、器官部分、または器官の培養、保存または維持、胚様体、胚、器官または器官部分の成長のために使用され得る。
【選択図】図10
特許請求の範囲【請求項１】
クロマン１（Ｃｈｒｏｍａｎ１）と、
エムリカサン（Ｅｍｒｉｃａｓａｎ）およびエムリカサンの誘導体であるＱ－ＶＤ－ＯＰｈのうちの一方または両方とを含む培地組成物。
続きを表示（約 890 文字）【請求項２】
トランス－ＩＳＲＩＢおよびポリアミンのうちの１つまたは両方をさらに含む請求項１に記載の培地組成物。
【請求項３】
前記培地組成物は、培地に取り込まれたとき、５０ｎＭ～８０μＭの濃度のトランス－ＩＳＲＩＢを提供するように配合される請求項２に記載の培地組成物。
【請求項４】
前記ポリアミンはスペルミンおよびスペルミジンを含み、前記培地組成物は、培地に取り込まれたとき、０．５ｎＭ～１ｍＭの濃度のスペルミン、および／または０．５ｎＭ～１ｍＭの濃度のスペルミジンを提供するように配合される請求項２に記載の培地組成物。
【請求項５】
前記ポリアミンは、プトレシンをさらに含み、前記培地組成物は、前記培地に取り込まれたとき、０．５ｎＭ～１ｍＭの濃度のプトレシンを提供するように配合される、請求項４に記載の培地組成物。
【請求項６】
前記培地組成物は培地に取り込まれたとき、４ｎＭ～８０μＭの濃度のクロマン１を提供するように配合される、請求項１～５のいずれか１項に記載の培地組成物。
【請求項７】
前記培地組成物は、培地に取り込まれたとき、１００ｎＭ～８０μＭの濃度のエムリカサンおよび／またはＱ－ＶＤ－ＯＰｈを提供するように配合される請求項１～６のいずれか１項に記載の培地組成物。
【請求項８】
インビトロまたはエクスビボで少なくとも１つの哺乳類細胞を支持するように構成される成分と、クロマン１と、エムリカサンおよびエムリカサンの誘導体であるＱ－ＶＤ－ＯＰｈのうちの一方または両方とを含む培地組成物。
【請求項９】
トランス－ＩＳＲＩＢをさらに含む、請求項８に記載の培地組成物。
【請求項１０】
５０ｎＭ～８０μＭの有効濃度においてトランス－ＩＳＲＩＢを含み、トランス－ＩＳＲＩＢの前記有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のトランス－ＩＳＲＩＢ濃度である請求項９に記載の培地組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、細胞生物学、生物工学、幹細胞生物学、再生医療の分野、および関連する分野に関し、限定するものではないが、多能性幹細胞、組織および器官を含む哺乳類細胞の培養に有用な組成物および方法に関連する。
続きを表示（約 5,500 文字）【背景技術】
【０００２】
多能性は、幹細胞がヒトの体の任意の細胞タイプに分化することを可能にする注目に値する細胞状態である。多能性幹細胞、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術の出現は、創薬、疾患モデリング、および再生医療に対して大きな可能性を有する。ｉＰＳＣ技術は、非多能性細胞を多能性細胞にリプログラミングすることを含み、それによって任意の個体から多能性細胞の人工的な生成を可能にする。結果として生じるｉＰＳＣは、所望の遺伝的および／または免疫学的バックグラウンドを有してドナー細胞から生成され得るので、治療および研究目的のために魅力的である。ｉＰＳＣの治療および研究可能性を完全に利用するために、それらの細胞培養条件は、化学的に定義された培地および十分に特徴づけられた試薬を必要とする。ｉＰＳＣ培養条件はまた、大規模な前臨床および臨床適用に適合可能であるべきである。そのような適用のいくつかの例は、細胞置換治療、遺伝子治療およびゲノム編集である。
【０００３】
第１胚性幹細胞（ＥＳＣ）株の樹立時から、多能性幹細胞は、細胞の解離およびルーチン的な継代に対して大いに影響を受けやすいことが知られていた。他のタイプの細胞培養と比較して、多能性幹細胞の培養は、長期間にわたって適度に高い細胞生存率を維持するため、および多能性幹細胞の未分化状態を維持するために、培養条件に特別の注意を払う必要がある。ヒト多能性幹細胞は、とりわけ細胞を酵素的に解離して単一の細胞にし、クローン分析に必要とされる非常に低い細胞密度で、または１ウェルあたり単一の細胞条件の場合、細胞培養条件に対して特に影響を受けやすい。単一細胞クローニングのための現在入手可能な選択肢は、成果に乏しく、労働集約的である。単一細胞クローニングの結果の改善は、例えば、個別細胞治療による遺伝的欠陥の修正、疾患モデリングのための遺伝子変異の導入、または創薬用のレポーター細胞株作成のための導入遺伝子の導入などの前臨床研究および臨床適用のためのｉＰＳＣのゲノム編集など様々な適用に重要である。
【０００４】
いくつかの化合物は、幹細胞培養の結果を改善することへの試みとして、細胞の培地サプリメントとして使用されてきた。例えば、Ｙ－２７６３２と名付けられたＲｈｏ－結合プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤は培養中の多能性幹細胞の生存を改善する。ブレビスタチン、チアゾビビン、ピリンテグリン（ｐｙｒｉｎｔｅｇｒｉｎ）およびピナシジルなどのいくつかの他の化合物も使用されるが、Ｙ－２７６３２は未だ幹細胞分野で最も広く使用される試薬である。特別なツールを使用した機械的な継代、非トリプシンプロテアーゼを使用した酵素的継代、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用した酵素フリーな継代などの様々な細胞継代方法が細胞培養中の細胞ストレスを軽減する目的で開発されてきた。この分野における多くの開発にもかかわらず、多能性幹細胞の培養中に生じる問題は未だ解決されていない。多能性幹細胞培養は挑戦的で、労働集約的で、人為的ミスを起こしやすく、再現が難しいままであった。多能性幹細胞の培養のための改善されたプロセスおよび組成物が必要とされているが、そのようなプロセスおよび組成物はまた、他の哺乳類細胞、組織および器官の培養を改善するために適合され得る。例えば、多くの広く使用される癌細胞株は、経時的に遺伝的変化を獲得しながら、培養中で長年維持され、これらの細胞株は忠実にインビボの癌細胞生物学を表していない可能性がある。同時に、原発腫瘍から細胞株を樹立することは、インビトロの細胞生存が低いことによって困難な課題であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、原発腫瘍から新たな癌細胞株を樹立するための改善されたプロセスおよび組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載され、本発明の実施形態に含まれるのは、哺乳類細胞、組織および／または器官の培養中の増殖および維持に有用な方法、組成物およびキットである。多能性幹細胞は、細胞培養条件に対して大いに影響を受けやすく、酵素的な細胞の解離、凍結保存／解凍の有無に関わらずルーチン的な継代中、および２次元および３次元培養において分化が促されたとき、アポトーシスが起こる。発明者らは、特定の小さい化合物、その中にはクロマン１（Ｃｈｒｏｍａｎ１）、エムリカサン（Ｅｍｒｉｃａｓａｎ）などのカスパーゼ－３阻害剤、トランス－ＩＳＲＩＢおよびポリアミン、および／またはそのような化合物の組み合わせがあるが、それらは、培養中の多能性幹細胞の生存を優位に改善することを発見した。この発見に関連して、発明者らは本明細書に記載される組成物、キット、および方法を考案し、それらは多能性幹細胞だけでなく、様々な他の哺乳類細胞、組織または器官の培養の結果を改善するために使用され得る。したがって、本明細書に記載される方法の様々な実施形態は、哺乳類細胞（限定するものではないが、多能性幹細胞を含む）組織および／または器官の培養に、発明者らによって考案された組成物および／またはキットを利用する。とりわけ、本明細書に記載される組成物、キット、および方法は、経済的な培養プロセスの開発、費用対効果の高い新たな細胞株の樹立、薬物および／または毒物学スクリーニングのための細胞培養のスケーラビリティ、細胞の拡大培養の堅牢性および標準化、細胞分化プロトコルの再現性の大幅な改善、および、個別化医療のための遺伝子治療およびゲノム編集などの細胞培養を含む適用の改善を可能にする。本発明の組成物、キット、および方法の利点は、本文書全体を通して説明され、添付の図面において示される。
【０００７】
本明細書に使用されるとき、用語「発明」、「本発明（“ｔｈｅｉｎｖｅｎｔｉｏｎ”、“ｔｈｉｓｉｎｖｅｎｔｉｏｎ”および“ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本特許出願の主題および以下の特許請求の範囲の全てに広く言及することを意図している。これらの用語を含む記述は、本明細書に記載されている主題を制限しないこと、または、以下の特許請求の範囲の意味または範囲を制限しないことを理解されたい。本発明の対象となる実施形態は、この要約ではなく、特許請求の範囲によって定義される。この要約は、本発明の様々な態様の高レベルの概要であり、本文書および添付の図面に記載および図示されている概念のいくつかを導入している。この要約は、クレームされた主題の重要な、または、本質的な特徴を特定することを意図せず、または、クレームされた主題の範囲を決定するために分離して使用することも意図されていない。主題は、明細書全体の適切な部分、任意のまたは全ての図、および各クレームを参照して理解されたい。本文書は、本発明の様々な実施形態を説明し、参照している。特定の実施形態が、本発明の範囲を定義することを意図していない。むしろ、実施形態は、少なくとも本発明の範囲内に含まれる様々な方法、組成物、キット、システムなどの非限定的な例を提供するにすぎない。いくつかの本発明の実施形態は以下に要約され、他の実施形態は本文書の他の場所で説明および示されている。
【０００８】
例示的な本発明の実施形態は、クロマン１および／またはその誘導体、および１つ以上のエムリカサンおよび／またはその誘導体などのカスパーゼ－３阻害剤を含む組成物を含む。組成物は、トランス－ＩＳＲＩＢおよびポリアミンのうちの１つまたは両方をさらに含み得る。組成物の実施形態は、培地に取り込まれたとき、約４ｎＭ～約８０μＭ、約４ｎＭ～約４０μＭ、約１０ｎＭ～約２０μＭ、約２０ｎＭ～約１０μＭまたは約３０ｎＭ～約５００ｎＭの濃度のクロマン１および／またはその誘導体を提供するように配合され得る。組成物の実施形態は、培地に取り込まれたとき、約１００ｎＭ～約８０μＭ、約１００ｎＭ～約４０μＭ、約２００ｎＭ～約３０μＭ、約３００ｎＭ～約２０μＭの濃度のエムリカサンおよび／またはその誘導体を提供するように配合され得る。組成物の実施形態は、培地に取り込まれたとき、約５０ｎＭ～約８０μＭ、約５０ｎＭ～約６．２５μＭ、約１００ｎＭ～約６．２５μＭ、または約２００ｎＭ～約６．２５μＭの濃度のトランス－ＩＳＲＩＢを提供するように配合され得る。組成物の実施形態は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシンのうちの１つ以上を含むポリアミンを含み得、そのような実施形態は、培地に取り込まれたとき、約０．５μＭ～１ｍＭの濃度のポリアミンを提供するように配合され得る。組成物の実施形態は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシンのうちの１つ以上を含むポリアミンを含み得、そのような実施形態は、培地に取り込まれたとき、約０．５ｎＭ～１ｍＭの濃度のスペルミン、および／または約０．５ｎＭ～１ｍＭの濃度のスペルミジン、および／または約０．５ｎＭ～１ｍＭの濃度のプトレシンを提供するように配合され得る。
【０００９】
例示的な本発明の実施形態は、インビトロまたはエクスビボで少なくとも１つの哺乳類細胞を支持するように構成された成分とクロマン１および／またはその誘導体とを含む培養培地組成物などの培地を含む。例えば、培地組成物の実施形態は、約４ｎＭ～８０μＭ、４ｎＭ～４０μＭ、１０ｎＭ～２０μＭ、２０ｎＭ～１０μＭまたは３０ｎＭ～５００ｎＭの有効濃度においてクロマン１および／またはその誘導体を含み得、クロマン１および／またはその誘導体の有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のクロマン１および／またはその誘導体の濃度である。培地組成物の実施形態は、エムリカサンおよび／またはその誘導体をさらに含み得る。例えば、培地組成物の実施形態は、約１００ｎＭ～８０μＭ、１００ｎＭ～４０μＭ、２００ｎＭ～３００μＭ、３００ｎＭ～２０μＭの有効濃度においてエムリカサンを含み得、エムリカサンおよび／またはその誘導体の有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のエムリカサンおよび／またはその誘導体の濃度である。培地組成物の実施形態は、トランス－ＩＳＲＩＢをさらに含み得る。例えば、培地組成物の実施形態は、約５０ｎＭ～８０μＭ、５０ｎＭ～６．２５μＭ、１００ｎＭ～６．２５μＭ、または２００ｎＭ～６．２５μＭの有効濃度においてトランス－ＩＳＲＩＢを含み得、トランス－ＩＳＲＩＢの有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中のトランス－ＩＳＲＩＢの濃度である。培地組成物の実施形態は、スペルミン、スペルミジンおよびプトレシンのうちの１つ以上を含むポリアミンをさらに含み得る。そのような培地組成物の実施形態は、約０．５ｎＭ～１ｍＭの有効濃度のスペルミン、約０．５ｎＭ～１ｍＭの有効濃度のスペルミジン、約０．５ｎＭ～１ｍＭの有効濃度のプトレシンを含み得、スペルミン、スペルミジンおよび／またはプトレシンのうちのそれぞれの有効濃度は、さらなる希釈なしで使用される作業培地中の濃度である。
培地組成物の実施形態において、インビトロまたはエクスビボで少なくとも１つの哺乳類細胞を支持するように構成される成分は、緩衝液、無機塩、必須アミノ酸、炭水化物、脂肪酸、脂質、ビタミン、微量元素のうちの１つ以上を含み得る。培地組成物の実施形態は、使用される前に溶解されるように配合された液体または固体の培養培地濃縮物を包含する。培地組成物の実施形態はまた、さらなる希釈なしで使用されるように配合された培養培地などの培地を包含する。培地組成物の複数の実施形態は、液体、半固体、固体培地を包含する。培地組成物の複数の実施形態は、規定培地および非規定培地を含む。培地組成物の複数の実施形態は、胚性幹細胞、非胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、多分化能幹細胞、成体幹細胞、始原細胞、分化細胞、単離された初代細胞、二次細胞、不死化細胞、細胞株細胞、生殖細胞、体細胞、改変細胞（遺伝的に改変された細胞を含む）、ヒト細胞またはヒト由来の細胞のうちの１つ以上の培養または保存のために構成され得る。培地組成物の複数の実施形態は、複数の細胞、細胞培養物、組織培養物、組織、器官、器官部分、胞胚葉、胚様体または胚のうちの１つ以上の培養または保存のために構成され得る。
【００１０】
例示的な本発明の実施形態は、本発明の実施形態による組成物と、インビトロまたはエクスビボで少なくとも１つの哺乳類細胞を支持するように構成された培養培地成分などの培地とを含むキットを含む。いくつかの例示的な実施形態において、そのようなキットは、インビトロまたはエクスビボで少なくとも１つの哺乳類細胞の増殖のための培養容器、支持部または足場のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの例示的な実施形態において、そのようなキットは、インビトロまたはエクスビボでの少なくとも１つの哺乳類細胞の保存のための容器および他の構成要素のうちの１つ以上をさらに含み得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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