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公開番号2025041765
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-26
出願番号2024224850,2022538920
出願日2024-12-20,2020-12-23
発明の名称単純化されたポリヌクレオチド配列検出法
出願人バイオフィデリティ・リミテッド
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/68 20180101AFI20250318BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】改善されたポリヌクレオチド検出のための方法を提供する。
【解決手段】試料中に存在する所定の核酸分析物におけるターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって:(a)i.一本鎖プローブオリゴヌクレオチドA0;ii.加ピロリン酸分解酵素;およびiii.リガーゼを含む第一の反応混合物に核酸分析物を導入し、ここで、分析物は一本鎖プローブオリゴヌクレオチドA0にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、A0の3’端が二本鎖複合体を形成し、A0は3’端から3’-5’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖A1を生成し、A1は連結を経てA2を形成する;(b)先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はA2またはその一部、あるいはA2またはその一部の多数コピーであり、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する工程を含む、前記方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
試料中に存在する所定の核酸分析物におけるターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
（ａ）
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ
０
；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；および
ｉｉｉ．リガーゼ
を含む第一の反応混合物に、１つまたはそれより多い核酸分析物を導入し、
ここで、分析物は一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ
０
にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ
０
の３’端が二本鎖複合体を形成し、そしてＡ
０
は３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ
１
を生成し、そしてＡ
１
は連結を経てＡ
２
を形成する；
（ｂ）先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はＡ
２
またはその一部、あるいはＡ
２
の多数コピーまたはその一部の多数コピーであり、そしてそこから分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程を含む、前記方法。
続きを表示（約 2,100 文字）【請求項２】
第一の反応混合物が、ピロリン酸イオンの供給源をさらに含むことでさらに特徴づけられる、請求項１に請求されるような方法。
【請求項３】
第一の反応混合物が、Ａ
０
の一部に実質的に相補的である少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）をさらに含むことでさらに特徴づけられる、請求項１または請求項２に請求されるような方法。
【請求項４】
第一の反応混合物が増幅酵素をさらに含むことでさらに特徴づけられる、請求項３に請求されるような方法。
【請求項５】
工程（ａ）の産物を、工程（ｂ）の前に第二の反応混合物に導入し、前記の第二の反応混合物が、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドおよびｄＮＴＰを含むことでさらに特徴づけられる、請求項１または請求項２に請求されるような方法。
【請求項６】
第二の反応混合物が増幅酵素をさらに含むことでさらに特徴づけられる、請求項５に請求されるような方法。
【請求項７】
第一の反応混合物が：
１つまたはそれより多いリガーゼ；および
Ａ
２
上の隣接配列に相補的な２つまたはそれより多いＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドであって、プローブがＡ
２
へのアニーリングに成功した場合、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド
をさらに含むことでさらに特徴づけられ、
Ａ
２
の存在下で、２つのＬＣＲプローブがＡ
２
へのアニーリングに成功し、そして共に連結されて１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、これが次いで、第二ラウンドの共有連結の新規ターゲットとして働き、関心対象のターゲット、この場合にはＡ
２
の幾何級数的増幅を導き、これを次いで検出する
請求項１または請求項２に請求されるような方法。
【請求項８】
工程（ａ）の産物を、工程（ｂ）の前に第二の反応混合物に導入し、前記の第二の反応混合物が：
１つまたはそれより多いリガーゼ；および
Ａ
２
上の隣接配列に相補的な２つまたはそれより多いＬＣＲプローブオリゴヌクレオチドであって、プローブがＡ
２
へのアニーリングに成功した場合、一方のＬＣＲプローブの５’リン酸が他方のＬＣＲプローブの３’ＯＨにすぐ隣接する、前記プローブオリゴヌクレオチド
を含むことでさらに特徴づけられ、
Ａ
２
の存在下で、２つのＬＣＲプローブがＡ
２
へのアニーリングに成功し、そして共に連結されて１つのオリゴヌクレオチド分子を形成し、これが次いで、第二ラウンドの共有連結の新規ターゲットとして働き、関心対象のターゲット、この場合にはＡ
２
の幾何級数的増幅を導き、これを次いで検出する
請求項１または請求項２に請求されるような方法。
【請求項９】
第一の反応混合物が：
フルオロフォアの蛍光が、フルオロフォアが互いに近接していることによって、あるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に近接していることによってのいずれかで、消光されるように配置されている、１つまたは多数のフルオロフォアを含む、連結部位を含むＡ
２
の領域に相補的なオリゴヌクレオチド；
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
をさらに含むことでさらに特徴づけられ；
Ａ
２
の存在下で、標識オリゴヌクレオチドが消化されて、フルオロフォアが互いに分離されるかまたはその対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがって、Ａ
２
の存在が検出されるようになる
請求項１または請求項２に請求されるような方法。
【請求項１０】
工程（ａ）の産物を、工程（ｂ）の前に第二の反応混合物に導入し、前記の第二の反応混合物が：
フルオロフォアの蛍光が、フルオロフォアが互いに近接していることによって、あるいは１つまたはそれより多い蛍光消光剤に近接していることによってのいずれかで、消光されるように配置されている、１つまたは多数のフルオロフォアを含む、連結部位を含むＡ
２
の領域に相補的なオリゴヌクレオチド；
二本鎖特異的ＤＮＡ消化酵素
を含むことでさらに特徴づけられ；
Ａ
２
の存在下で、標識オリゴヌクレオチドが消化されて、フルオロフォアが互いに分離されるかまたはその対応する消光剤から分離され、そして蛍光シグナル、そしてしたがって、Ａ
２
の存在が検出されるようになる
請求項１または請求項２に請求されるような方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、感染性疾患および移植臓器拒絶の同定に用いられるものを含めて、多数の診断マーカーの存在に関して試験するために適した、単純化されたポリヌクレオチド配列検出法に関する。これはまた、確実に、そして低コストで、マーカーパネルを同定しなければならないコンパニオン診断試験にも有用である。
続きを表示（約 6,900 文字）【発明の概要】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、確実に検出され、そして／または定量化されうるレベルまで、実験室試料および診断試料に存在するＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するための、周知であり、そして強力な技術である。しかし、低レベルのこうした分子を含有する分析物試料を調べる目的のために適用した場合、いくつかの限界に悩まされる。第一に、この技術は、単一ターゲット分子と同程度に少ない分子を検出可能であるが、試料中に存在する他の核酸配列の望ましくない増幅のため、偽陽性結果を生じる傾向がある。このため、反応を開始するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーの選択が重要となり；これは次に、必要なレベルの特異性を持つプライマーを設計することを比較的複雑にする。その結果、現在、市場で入手可能であるＰＣＲに基づく多くの試験は、限定された特異性を有する。
【０００３】
第二の欠点は、ＰＣＲに基づく方法の多重化が、実際のところ、プライマー－プライマー相互作用の回避のために、最大、数十のターゲット配列（しばしば１０以下）に限定され、比較的狭い操作ウィンドウの必要性を生じることである。
【０００４】
別の問題は、ＰＣＲ反応は、指数関数方式でサイクリングするため、ターゲットの定量化が困難なことであり；反応効率の小さな変動が、生成される検出可能な物質の量に多大な影響を有する。したがって、適切な対照および較正が整っていても、定量化は、典型的には、ほぼ１／３からほぼ３倍の正確さに限定される。
【０００５】
最後に、ＰＣＲ増幅法による研究のためにターゲティングされる領域中の突然変異は、望ましくない副作用を有しうる。例えば、ターゲット生物が、試験プライマーによってターゲティングされる遺伝子領域中の突然変異を経て、多数の偽陰性が生じたため、ＦＤＡに認可された試験が撤回されなければならなかった例があった。逆に、特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を増幅のためにターゲティングした場合、野生型変異体が存在すると、ＰＣＲ法は、しばしば、偽陽性を生じるであろう。これを回避するには、非常に注意深いプライマー設計が必要であり、そしてさらに多重化の有効性が限定される。癌試験／スクリーニングまたはコンパニオン診断において一般的な要件であるような、ＳＮＰパネルに関する検索の際には、これは特に関連する。
【０００６】
ＵＳ２００６／１１０７６５Ａ１（Ｗａｎｇら）は、典型的には非効率的であり、そしてそれほど特異的な反応ではない、ミスマッチ部位での酵素的切断を解説する。さらに、試料中の類似の配列に対する、Ｗａｎｇらに開示されるようなプローブのオフターゲットハイブリダイゼーションは、ミスマッチ部位での切断の使用のため、偽陽性結果を生じる。同じ位または近傍の位の２つの異なる遺伝子変異体は、すべて、同じプローブの切断および増幅を生じるため、こうした変異体の間を区別することもまた不可能である。Ｗａｎｇらの解説は、したがって、低感度および低特異性の反応スキームを生じるであろう。対照的に、本発明によって開示するような方法の技術的効果は、ミスマッチによって有効にブロックされうる、ｄｓＤＮＡに対する高い特異性を持つ、迅速で効率的な方法を提供する。さらに、本発明の方法は、ターゲティングされる遺伝子変異体に非常に特異的であり
、同じ位または近傍の位での異なる変異体間の区別を可能にする。
【０００７】
ＵＳ２００９／２３９２８３Ａ１（Ｌｉｕら）は、加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）によって除去される伸長不能３’端の使用を解説し、これは３’ブロッキング修飾を除去可能なカスタムポリメラーゼの遺伝子操作を必要とする。対照的に、本発明は、存在するポリメラーゼに生得的な天然加ピロリン酸分解活性を利用し、そして３’ブロッキング修飾を使用しない。Ｌｉｕらに開示されるような方法はまた、続く増幅を可能にするため、プローブの一部からの末端塩基のみの除去に頼り、そして３’ブロッキング修飾の使用によって、この態様に限定される。対照的に、本発明で開示する方法は、反応を引き起こすためにプローブからの多数の塩基の進行性除去が必要である態様を可能にし、末端塩基の望ましくない除去を生じうる、バックグラウンドＤＮＡまたは他のプローブのいずれかに対する一過性のオフターゲットアニーリングに対して、反応を実質的によりロバストにする。
【０００８】
発明のサマリー
本発明者らは、現在、これらの制限の多くを克服するため、本発明者らの以前の特許（ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５２０１７）に使用した加ピロリン酸分解法を用いて本発明者らの経験の上に構築された、新規の単純化された方法を開発している。開発を行うにあたり、一本鎖オリゴヌクレオチド基質、あるいはブロッキング基またはヌクレオチドミスマッチを含む二本鎖基質では効率的に進行しない反応である、加ピロリン酸分解の二本鎖特異性を利用している。新規の方法は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５２０１７に開示するものよりも、より迅速で、より複雑でなく、そしてより安価に実行される。したがって、本発明にしたがって、所定の核酸分析物におけるターゲットポリヌクレオチド反応を検出する方法であって：
（ａ）
ｉ．一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ
０
；
ｉｉ．加ピロリン酸分解酵素；および
ｉｉｉ．リガーゼ
を含む第一の反応混合物に、１つまたはそれより多い核酸分析物を導入し、
ここで、Ａ
０
は３’端から３’－５’方向に加ピロリン酸分解されて、少なくとも部分的に消化された鎖Ａ
１
を生成し、そしてＡ
１
は連結を経てＡ
２
を形成する；
（ｂ）先の工程の産物由来のシグナルを検出する、ここで、産物はＡ
２
またはその一部、あるいはＡ
２
の多数コピーまたはその一部の多数コピーであり、そしてそこから分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程を含む、前記方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法を適用してもよい分析物は、探しているターゲットポリヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸、例えば天然存在または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。１つの態様において、分析物は、典型的には、該分析物および他の生物学的物質を含有する水溶液中に存在し、そして１つの態様において、分析物は、試験の目的のための関心対象ではない他のバックグラウンド核酸分子と共に存在するであろう。いくつかの態様において、分析物は、これらの他の核酸構成要素に比較して、少量で存在するであろう。好ましくは、例えば、分析物が細胞性物質を含有する生物学的標本に由来する場合、方法の工程（ａ）を実行する前に、これらの他の核酸および外来性の生物学的物質のある程度またはすべては、試料調製技術、例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィまたは電気泳動を用いて、除去されているであろう。適切には、分析物は、哺乳動物被験体（特にヒト患者）から採取された生物学的試料、例えば血液、血漿、痰、尿、皮膚または生検に由来する。１つの態様において、存在するいかなる細胞も破壊することによって分析物を放出させるため、生物学的試料は、溶解に供されるであろう。他の態様において、分析物は、試料自体の中で、すでに遊離した形で；例えば血液または血漿中に循環している細胞不
含ＤＮＡとして存在してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
単純化されたポリヌクレオチド配列検出法に関するプロトコル。
前増幅工程中に５’－３’エキソヌクレアーゼ消化工程が起こる場合、およびこの消化工程がプロトコルの加ピロリン酸分解／連結工程に移動した場合（プロトコル３～５におけるようなもの）に検出される蛍光のレベル（特定のターゲット分析物配列の存在に相当する）を比較するグラフ。この例では、５’－３’エキソヌクレアーゼはラムダである。
本発明者らは、ある範囲の異なるＰＰＬ酵素を用いて、本発明のプロトコル３の方法を試験した。図３（Ａ）は、Ｍａｋｏ、ＫｌｅｎｏｗおよびＢｓｕを用いた１％ＭＡＦＴ７９０Ｍの検出を示す。図３（Ｂ）は、異なるＰｐｉ濃度範囲で、ＢｓｔＬＦを用いた０．５％ＭＡＦＴ７９０Ｍの検出を示す。４つの酵素はすべて、広範な最適化を伴わなくても非常によく働いた。
４つの異なる加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）酵素：Ｍａｋｏ、Ｋｌｅｎｏｗ、ＢｓｕおよびＢｓｔＬＦを用い、本発明のプロトコル４の方法を用いた、１％ＭＡＦ、Ｔ７９０Ｍの検出に関する結果。
プロトコル１およびプロトコル４にしたがった方法を用い、０．５％、０．１０％および０．０５％ＭＡＦエクソン１９ｄｅｌ＿６２２３の存在下での検出される蛍光（特定のターゲット分析物配列の存在に相当する）のレベルを示すグラフ。
本発明者らは、プロトコル４にしたがって、０．１０％、０．５０％および１％ＭＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０Ｔ７９０Ｍを検出した。
ＲＣＡ工程においてエキソヌクレアーゼの使用を伴うおよび伴わない、１％ＭＡＦでのＥＧＦＲエクソン２０突然変異Ｔ７９０Ｍの検出。
本発明者らは、０．５％ＭＡＦＥＧＦＲエクソン２０Ｔ７９０Ｍに関して検出されるシグナルの強度に対して、ＰＰＬ：ＲＣＡ混合比がどのような影響を有するかを調べ、その結果を図８に示す。見て取れるように、１：２のＰＰＬ：ＲＣＡ混合比は最低のシグナル強度を生じるが、最も早い時点でシグナルを生じる。これに続いて時間的に近いのが１：４ＰＰＬ：ＲＣＡ混合物であり、これはより高いシグナル強度を有する。最大のシグナル強度は、反応の最も遅い時点で、１：８ＰＰＬ：ＲＣＡ混合物に関して見られる。
図９は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ（５０℃および６０℃）およびＳｙｔｏ８２（５０℃および６０℃）を用い、プロトコル４にしたがって行った比較実験の結果を示す。
本発明者らは、プロトコル４にしたがって、ＲＣＡに関する、２つの異なる酵素、ＢＳＴＬ．ＦおよびＢＳＴ２．０ＷＳの使用を調べた。
本発明者らは、異なるＰＰＬ：ＲＣＡ混合比で、ＲＣＡ反応に対する異なるＰＰＬ酵素の効果を調べた。この結果は、図１１（Ａ）１：４ＰＰＬ：ＲＣＬおよび図１１（Ｂ）１：８ＰＰＬ：ＲＣＬで見られうる。すべてのＰＰＬ酵素は、ＢＳＴＬ．Ｆ．以外は、１：４ＰＰＬ：ＲＣＡ比でＲＣＡ反応に影響を及ぼす。１：８ＰＰＬ：ＲＣＡ比では、ＢＳＴＬ．ＦおよびＫｌｅｎｏｗ以外のすべての酵素がＲＣＡ反応に影響を及ぼす。
オリゴヌクレオチド３および４が両方存在する場合、反応中で蛍光シグナルがより迅速に現れることを示し、オリゴヌクレオチド３の加ピロリン酸分解および連結が第一の反応混合物で生じていることを示す、実施例１１に関する蛍光測定結果。
同じ反応における１％アレル割合でのＴ７９０ＭおよびＣ７９７Ｓ＿２３８９突然変異の検出。
０．５％アレル割合での１つのウェル中で同時の３つの突然変異：Ｇ７１９Ｘ＿６２３９、Ｇ７１９Ｘ＿６２５２、Ｇ７１９Ｘ＿６２５３の検出。
分析物ターゲット配列に対して、Ａ
２
を形成するＡ
１
の環状化の模式図。Ａ
０
はＡ
０
の３’端から３’－５’方向にターゲットに対して進行性に消化されて、部分的に消化された鎖Ａ
１
を形成し、これを工程（Ａ）および（Ｂ）に示す。この進行性消化は、Ａ
０
／Ａ
１
の５’に相補的なターゲット領域を明らかにし、そして次いで、Ａ
１
の５’端がこの領域にハイブリダイズする。これを工程（Ｃ）に示す。次いで、Ａ
１
は共に連結されて、環状化Ａ
２
を形成する。工程（Ｄ）。
Ａ
１
を形成するＡ
０
の加ピロリン酸分解が起こり、その後、ターゲット配列に対して、Ａ
２
を形成するＡ
１
の環状化が続く態様からの結果を示す、実施例１４に関する蛍光測定結果。
一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ
０
は、ターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ
０
の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。本発明のこの単純化された態様において、ターゲットにアニーリングしていないＡ
０
が、どのように方法のさらなる工程に関与しないかを例示するため、存在するＡ
０
の２つの分子および１つのターゲットポリヌクレオチド配列がある。この例示的例において、Ａ
０
の３’端はターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングする一方、Ａ
０
の５’端はアニーリングしない。Ａ
０
の５’端は、５’化学ブロッキング基、共通プライミング配列およびバーコード領域を含む。部分的に二本鎖である第一の中間産物は、加ピロリン酸分解酵素の存在下で、Ａ
０
の３’端から３’－５’方向で、加ピロリン酸分解を経て、部分的に消化された鎖Ａ
１
、分析物、およびターゲットにアニーリングしなかった未消化Ａ
０
分子を生じる。
Ａ
１
は、一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングし、そしてＡ
１
鎖は、Ｂに対して５’－３’方向に伸長されてオリゴヌクレオチドＡ
２
を生成する。この例示的例において、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学ブロックを有する。いかなる未消化Ａ
０
もトリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングするが、５’－３’方向に伸長されて、方法の後半部分のターゲットである配列を生成することは不可能である。この例では、Ａ
２
は少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングされて、Ａ
２
またはＡ
２
の領域の多数コピーが生成される。
Ａ
１
はスプリントオリゴヌクレオチドＤにアニーリングし、そして次いでその３’および５’端での連結によって環状化される。ここで環状化されたＡ
２
は少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングされて、そしてＡ
２
またはＡ
２
の領域の多数コピーが生成される。この例示的例において、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例では化学物質）により、またはＤの３’端およびＡ
２
の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ
１
に対して伸長することが不可能である。
スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’領域は、Ａ
１
の３’領域にアニーリングする一方、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’領域は、連結プローブＣの５’領域にアニーリングする。したがって、Ａ
１
、Ｃ、および任意選択で５’－３’方向でのＡ
１
の伸長によって形成されてＣの５’端に連結される中間体領域で構成される、第二の中間産物Ａ
２
が形成される。この例示的例において、連結プローブＣは、３’化学ブロッキング基を有し、したがって、３’－５’エキソヌクレアーゼを用いて、いかなる非連結Ａ
１
も消化することも可能である。Ａ
２
を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そして多数コピーのＡ
２
またはＡ
２
の領域を生成する。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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