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公開番号2025041733
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-26
出願番号2024221777,2021555800
出願日2024-12-18,2020-03-17
発明の名称DNA試料のメチル化変化を検出するための方法およびシステム
出願人ニュークレイクスリミテッド
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6844 20180101AFI20250318BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】DNA試料、特に血漿および尿などの生体液から得られたDNA試料におけるメチル化変化を高感度に検出するための方法およびシステムを提供する。
【解決手段】DNA試料中のメチル化変化を感度よく検出する方法であって、(a)DNA試料を提供することと、(b)前記DNA試料を少なくとも1つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼまたは少なくとも1つのメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで消化し、単一反応混合物中、正常なDNAおよび疾患DNAの間で異なってメチル化されている少なくとも1つの制限遺伝子座と、少なくとも1つの対照遺伝子座とを同時増幅し、増幅産物のシグナル強度間の比率を、少なくとも1つの基準比率と比較することによって、前記DNA試料をメチル化比率分析にかけ、これにより、少なくとも1:100の検出感度で前記DNA試料のメチル化変化を検出することと、を含む、方法とする。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＤＮＡ試料中のメチル化変化を感度よく検出する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ試料を提供することであって、前記ＤＮＡ試料は、５％未満の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、提供することと、
（ｂ）前記ＤＮＡ試料を少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼまたは少なくとも１つのメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで消化し、前記消化されたＤＮＡから、単一反応混合物中、正常なＤＮＡおよび疾患ＤＮＡの間で異なってメチル化されている少なくとも１つの制限遺伝子座と、少なくとも１つの対照遺伝子座とを同時増幅し、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のそれぞれの増幅産物のシグナル強度間の比率を、少なくとも１つの基準比率と比較することによって、前記ＤＮＡ試料をメチル化比率分析にかけ、
これにより、少なくとも１：１００の検出感度で前記ＤＮＡ試料のメチル化変化を検出することと、を含む、方法。
続きを表示（約 570 文字）【請求項２】
前記ＤＮＡが、生体液試料から抽出された無細胞ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体液試料が、血漿、血清または尿である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ試料が、１％未満のｓｓＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ試料が、０．１％未満のｓｓＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ試料が、０．０１％未満のｓｓＤＮＡを含むか、またはｓｓＤＮＡを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
メチル化変化が、少なくとも１：５００の検出感度で前記試料において検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
メチル化変化が、少なくとも１：１，０００の検出感度で前記試料において検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
メチル化変化の検出が、前記ＤＮＡ試料が正常なＤＮＡまたは疾患のＤＮＡ試料であるかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ試料が正常なＤＮＡ試料またはがんのＤＮＡ試料であるかを決定することを含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ試料、特に血漿および尿などの生体液から得られたＤＮＡ試料におけるメチル化変化を高感度に検出するための方法およびシステムに関する。システムおよび方法は、疾患の診断に役立つ。
続きを表示（約 3,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡメチル化変化は、多くの種類のがんで発生することが知られており、孤立したＣｐＧの低メチル化や、主にＣｐＧアイランドで発生する高メチル化などを含む。具体的には、遺伝子サイレンシングにつながる、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域にあるＣｐＧアイランドの高メチル化は、広く研究されており、様々な種類のがんで実証されている。
【０００３】
腫瘍はＤＮＡ断片または「無細胞ＤＮＡ」を生体液に放出するため、結果として、血漿や尿などの生体液から得られる「液体生検」において、腫瘍由来のＤＮＡ分子のメチル化変化が検出できる。従来の生検とは対照的に、液体生検は非侵襲的であり、腫瘍サブクローンの完全な遺伝的スペクトルをより適切に表す可能性がある。その結果、液体生検におけるがんに関連するメチル化変化の検出は、早期発見、予後、および治療的監視に大きな期待を抱くものである。ただし、液体生検で腫瘍由来のＤＮＡを検出するには、正常なＤＮＡのバックグラウンドが大きいのに関連して、腫瘍ＤＮＡが非常に少量しか存在しない可能性があるため、超高感度の生化学的手法が必要である。
【０００４】
ＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理とそれに続く定量的ＰＣＲに基づいて、液体生検でメチル化分子を検出するためのいくつかの技術が開発されており、分析感度は最大１：１０，０００である（Ｃｏｔｔｒｅｌｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２００４，３２（１）：ｅ１０；ＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎａｎｄＨａｎｓｅｎ，ＣｌｉｎＣｈｅｍ．，２００９，５５（８）：１４７１－８３；Ｚｏｕｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＣｈｅｍ．，２０１２，５８（２）：３７５－８３）。これらのアッセイに基づいて、血液および便中の結腸直腸癌の検出、および尿中の膀胱癌の検出のための市販の製品が導入された（Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＭｅｄ．，２０１６，５（１０）：２７６３－７２；Ｉｍｐｅｒｉａｌｅｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．，２０１４，３７０（１４）：１２８７－９７；ＶａｎＫｅｓｓｅｌｅｔａｌ．，ＪＵｒｏｌ．，２０１６，１９５（３）：６０１－７））。その人気にもかかわらず、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの変換は厄介なアッセイであり、鋳型ＤＮＡの分解や、その後のＰＣＲでのメチル化または非メチル化ＤＮＡの好ましい増幅を含む欠点がある。
【０００５】
バイサルファイトシーケンシングに基づく別の研究は、Ｍｏｓｓｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌ．９，Ａｒｔｉｃｌｅｎｕｍｂｅｒ：５０６８（２０１８）に記載されており、そこでは、血漿試料中の無細胞ＤＮＡがバイサルファイト変換および市販のメチル化アレイを使用して分析された。Ｍｏｓｓｅｔａｌ．は、血漿メチル化パターンを使用して、健康および病的状態の細胞型特異的ｃｆＤＮＡを同定した。Ｍｏｓｓｅｔａｌ．は、特に、混合実験を実施することにより、逆重畳積分を使用してがん検出の精度を評価した、結腸癌を有する患者からの血漿を健康なドナーの血漿と様々な比率で混合し、得られた混合物のメチロームを逆重畳積分した。アルゴリズムは、混合物中の結腸ＤＮＡの存在を、正しい比率で、３％まで正しく識別した（元のがん血漿試料の３３倍希釈）。
【０００６】
ＤＮＡメチル化分析のためのバイサルファイトに基づかない方法には、親和性／抗体濃縮またはメチル化感受性および／または依存性制限が含まれる。メチル化依存性制限に基づく方法には、示差的メチル化ハイブリダイゼーション、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小さなフラグメント濃縮、複合重亜硫酸塩制限分析、およびメチル化特異的多重ライゲーション依存性プローブ増幅が含まれる。これらのバイサルファイトに基づかない方法は、主にゲノムワイド解析に使用される。
【０００７】
特定の遺伝子座の分析のために、メチル化感受性および／または依存性制限酵素を利用するいくつかの方法が開発された。例えば、メチル化感受性制限、メチル化依存制限、二重消化および模擬消化を、その後の定量的ＰＣＲと組み合わせた方法が開発された（Ｏａｋｅｓｅｔａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．，２００６，１（３）：１４６－５２）が、分析された遺伝子座ごとに４つの別々の制限および増幅反応を実行する必要があるため、アッセイが複雑になり、入力ＤＮＡの量が限られている試料での適用が制限される。同様であるがより単純なアプローチは、メチル化依存性制限反応とそれに続く定量的リアルタイムＰＣＲ、および模擬消化およびＰＣＲ増幅された同じＤＮＡ試料との比較を採用している（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．，２００７，２（２）：８６－９５））。このアプローチは、肝細胞癌のメチル化レベルの定量分析のために別のチームによっても使用された（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，ＥｘｐＭｏｌＰａｔｈｏｌ．，２０１１，９１（３）：７０２－７）。より単純であるが、このアプローチでもなお、分析された遺伝子座ごとに２つの別々の消化とＰＣＲを実行する必要がある。この一般的な技法の別の変形法が、最近、肺癌、肺線維症、およびＣＯＰＤ患者のメチル化サインを検出するために採用された（Ｗｉｅｌｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．，２０１５，２（８）：９２９－３６）。この変形法では、メチル化感受性酵素を使用して単一の制限反応を実施した後、２ラウンド連続してＰＣＲ増幅を行った（高度に多重化された最初のラウンドとそれに続く単一遺伝子座ＰＣＲのラウンド）。各遺伝子座のメチル化のレベルは、その遺伝子座から得られたシグナルを、別々のウェルで増幅された対照遺伝子座から得られたシグナルと比較することによって決定された。このアプローチでは単一の制限反応しか使用しなかったが、２ラウンドの連続したＰＣＲ増幅を使用すると、かなり複雑なアッセイになる。さらに、前述の制限とそれに続くメチル化分析の増幅ベースのアッセイは、異なるＰＣＲウェルからのシグナルの比較に依存しており、アッセイが適切に実施された場合でも、各ウェルはわずかに異なる試薬濃度と熱条件を有するため、高レベルのノイズが発生する可能性がある。
【０００８】
メチル化感受性および／または依存性制限酵素に基づくメチル化分析のための別の方法は、本発明の出願人に譲渡されたＷＯ２０１１／０７０４４１に開示されている。より具体的には、ＷＯ２０１１／０７０４４１は、メチル化の差異に基づいてＤＮＡ試料を分類するための方法を開示し、この方法は、（Ａ）メチル化感受性および／またはメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡ試料を消化することと、（Ｂ）消化されたＤＮＡに対してＰＣＲを実行して、少なくとも２つのゲノム遺伝子座を同時増幅することであって、そのうちの少なくとも１つは、異なるＤＮＡカテゴリー間で異なってメチル化された制限遺伝子座である、増幅することと、（Ｃ）各増幅産物のシグナルの強度を決定することと、（Ｄ）遺伝子座によって生成されたシグナルの強度間のシグナル比率を計算することと、（Ｅ）シグナル比率を、ＤＮＡの異なるカテゴリーに対応する基準値と比較することであって、ここで、基準値がシグナル比率に最もよく対応するカテゴリーが、ＤＮＡ試料のカテゴリーであると決定される、比較することと、を含む。ＤＮＡ試料のカテゴリーには、例えば、異なる組織および／または生理学的／病理学的状態からのＤＮＡが含まれる。
【０００９】
本発明の出願人に譲渡されたＷＯ２０１７／００６３１７およびＷＯ２０１９／１４２１９３は、選択されたゲノム遺伝子座におけるＤＮＡメチル化変化に基づいて、膀胱癌を同定するための方法および肺癌を同定するための方法をそれぞれ開示している。方法は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後に検査ＤＮＡ試料から同時増幅された選択された遺伝子座間のシグナル強度比率を計算することと、これらの比率を、１つ以上の基準比率と比較することと、を含む。
【００１０】
ＤＮＡ試料のメチル化変化を検出するための改善された方法が必要であるが、これは、既存の方法よりも感度が高く、しかも正確である。例えば、非メチル化ＤＮＡの大きなバックグラウンド内での少量のメチル化ＤＮＡ分子の検出を改善する必要がある。このような方法は、疾患診断、特に腫瘍由来の循環ＤＮＡに基づくがん診断の分野で非常に望まれている。
【発明の概要】
（【００１１】以降は省略されています）

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