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公開番号2025041591
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-26
出願番号2024199821,2022151810
出願日2024-11-15,2016-06-03
発明の名称システムおよび方法
出願人スフィアフルイディクスリミテッド,Sphere Fluidics Limited
代理人個人,個人,個人
主分類C12Q 1/02 20060101AFI20250318BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】液滴を処理するための新規の器具及びカートリッジを提供する。
【解決手段】選別された微小流体液滴の自動化された選別及び分注を行うための微小流体カートリッジが提供される。該カートリッジは、選別領域に結合されている選別投入チャネルであって、選別領域は選別投入チャネル及び液滴方向付け器に結合され、液滴を選別投入チャネルから選別放出チャネルのうちの選択された1つに選択的に向ける2つ以上の選別放出チャネルを備える、選別投入チャネルと、選別放出チャネルのうちの1つに結合され、選択された液滴を微小流体カートリッジから分注して貯留容器内に回収する、液滴分注器であって、液滴分注器は、液滴をエマルジョン流から分注器放出チャネル内に排出して貯留容器内に回収するための液滴排出機構を備える、液滴分注器と、液滴分注器へのエマルジョン流量を制御するために選別領域と分注領域との間のエマルジョン流緩衝領域と、を備える。
【選択図】図4a
特許請求の範囲【請求項１】
１つまたは複数の実体を含有する液滴を供給する方法であって、
流体中に複数の実体を供給するステップと、
前記流体から液滴を調製するステップと、
前記液滴が前記複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有しているかどうか、または前記液滴が前記実体を含有していないかどうかを決定するステップと、
前記決定の結果に応じて前記液滴を選別するステップと、
前記選別された液滴を貯留容器内に分注するステップと、
を含み、分注する前記ステップは、選別する前記ステップの後に、
前記選別された液滴を含有する流体のための流体流路を選択するステップと、
前記選択された経路から前記選別された液滴を排出するステップと、
を含む、方法。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
分注する前記ステップは、
分注する前記選別された液滴を識別するステップと、
前記選別された液滴を前記流体の第１の流体流路から、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から第２の流体流路内に移送することによって抽出するステップと、
前記選別された液滴を前記第２の流体流路から前記貯留容器内に、圧力を前記第２の流体流路に印加することによって排出するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移送する前記ステップは、前記選別された液滴に圧力を印加して、前記第１の流体流路の一部にある間に分注し、その後、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から第２の流体流路内に移送し、前記選別された液滴を排出するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分注する前記ステップは、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から前記第２の流体流路に移送し、次いで、圧力を前記第２の流体流路に印加して前記液滴を排出させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
抽出する前記ステップは、前記選別された液滴が定められた数の前記実体を含むとき、および／または前記選別された液滴が定められた特性を持つ前記実体を含むときにのみ前記選別された液滴を抽出するステップを含み、特に、前記排出された液滴が前記単一のターゲット実体または前記実体の単一のターゲット組合せを含有する確率は、前記調製、決定、選別、および分注に基づき、９９．９％を超える高さ、特に、９９．９９％を超える高さ、より具体的には９９．９９７％を超える高さである、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
排出する前記ステップは、前記決定および／または前記実体の特性に応じて定められた位置で前記選別された液滴を排出するステップを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数の実体を培養し、および／または維持するために前記液滴をインキュベートするステップをさらに含み、特に、インキュベーション時に前記１つまたは複数の実体に対して安定性試験を実施するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記選別された液滴を前記第１の流体流路から前記第２の流体流路に移送する前記ステップは、前記選別された液滴をデカップラ内の前記第１の流体流路からデカップルするステップを含み、前記デカップラは、前記選別された液滴を前記第１の流体流路から分離し、前記分離された液滴を前記第２の流体流路に誘導するように構成される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
排出する前記ステップは、前記選別された液滴が輸送される流体を加熱するステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
培養培地流体を前記第２の流体流路内に注入して前記選別された液滴を前記培養培地流体内で排出するステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、１つまたは複数の実体、特に生物学的実体を含有する液滴を供給するためのシステムおよび方法に関する。
続きを表示（約 2,800 文字）【背景技術】
【０００２】
本明細書において、本発明者らは、エマルジョン、典型的には、一般的に界面活性剤安定化された、油中水のマイクロドロップレットを含むエマルジョンに関心がある。１つまたは複数の生体細胞などの１つまたは複数の生物学的実体が各液滴中に組み込まれ、次いで、たとえば、生物学的検定法を実施するために液滴内で実験が実施され得る。マイクロドロップレットは、潜在的に毎秒数千個を超える速度で生成され、処理され得る。
【０００３】
典型的には、油組成物は、フッ素および／または鉱物油、および好ましくは界面活性剤を、たとえば、約０．５～５％の体積比で含む。フルオラス油（fluorous oil）はマイクロドロップレットに酸素を輸送する能力に長けているので、フルオラス油の使用はマイクロドロップレットが生命体（living entity）を含有するときに特に有利である。界面活性剤は、重合体であるか、または小分子のいずれかであり得、たとえば、Ｋｒｙｔｏｘ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのペルフルオロエーテルのブロック共重合体から誘導された界面活性剤が使用され得る。マイクロドロップレット内の物質または検体は、たとえば、細胞、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、ビード、粒子、結晶、ミセル、巨大分子、酵素アッセイ用の物質、細胞小器官、細胞、たとえば、哺乳類細胞、酵母細胞、藻細胞もしくは細菌、ウイルス、プリオンなどの有機体を含み得る。典型的には、液滴は、大きい（または小さい）場合もあり得るが１～１２０μｍの範囲内の直径を有し、ナノリットルからフェムトリットルの範囲内にあり得る体積を構成する。
【０００４】
微小流体デバイス上に集積化された能動素子は、個別の液滴を制御するために使用することができ、たとえば、本発明者らは、特許文献１においてすでに説明しており、この技術は、連続流内に組み込むことによってマイクロドロップレットの含有物のオンチップで抽出を可能にする。マイクロドロップレットに関する他の一般的な背景先行技術は、ＲａｉｎＤａｎｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．の名前による特許／出願、たとえば、特許文献２に見ることができる。単細胞または粒子選別は、従来技術、たとえば、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３から知られている。
【０００５】
これらの技術は有用であるが、これらは拡張できる。たとえば、薬物耐性に関連するものなどの、非常に希な生物学的実体または事象における生物学的挙動を診断することを伴うあるクラスの厄介な問題がある。別の難題は、単一クローン性を保証することである、すなわち、薬物規制機関は、生物医薬品および他の化学的または生化学的実体が単一の生存可能な実体、または実体の特定の組合せから培養されることを要求することが多い。これは、たとえば、単細胞から、または複数の実質的に同一の生存可能な細胞から生じる細胞集団の培養は、細胞集団にまたがって単一クローン性が高い確率で生じることを保証するからである。なおも別の難題は、高い生産収率を有する発酵のために細胞のグループを選択するステップを伴う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
ＷＯ国際公開第２００９／０５０５１２号
国際公開第２００８／０６３２２７号
米国特許出願公開第２００８／００５３２０５号
【非特許文献】
【０００７】
「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓｏｎａｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｄｅｖｉｃｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇｄｒｏｐｌｅｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｄｒｏｐｌｅｔｓｏｒｔｉｎｇ」、ＢｉｏｍｅｄＭｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ２０１３年、１５（３）：５５３－６０
「ＡｎａｌｙｚｉｎｇＣａｎｃｅｒａｔＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈＤｒｏｐｌｅｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ＲａｉｎＤａｎｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒａｉｎｄａｎｃｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｒｄｔ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１２／０５／ｐｏｓｔｅｒ＿ａｎａｌｙｚｉｎｇ＿ｃａｎｃｅｒ＿ｗｉｔｈ＿ｄｒｏｐｌｅｔ＿ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｐｄｆ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの問題に対処するために使用できる技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、１つまたは複数の実体を含有する液滴を供給する方法が提供され、この方法は、流体中に複数の実体を供給するステップと、前記流体から液滴を調製するステップと、前記液滴が前記複数の実体のうちの１つまたは複数の実体を含有しているかどうか、または前記液滴が前記実体を含有していないかどうかを決定するステップと、前記決定の結果に応じて前記液滴を選別するステップと、前記選別された液滴を貯留容器内に分注するステップとを含み、分注する前記ステップは、選別する前記ステップの後に、選別された液滴を含有する流体のための流体流路を選択するステップと、選択された経路から選別された液滴を排出するステップとを含む。
【００１０】
発明者らは、単一の実体、または単一の液滴、たとえば、ピコドロップレット（その体積は約１０００または数千ピコリットル未満である）中の実体の画成された単一の組合せを取得する確率は、この方法の実施形態を使用して高くすることができることを理解している。方法の調製ステップ、決定／選別ステップ、および分注ステップの各々は、単一の液滴中の１つまたは複数のターゲット実体を取得することに対する特定の確率を有している。この方法において、これらのステップを組み合わせることによって、９９．９％を超える、特に９９．９９％を超える高い確率で単一の液滴中の単一のターゲット実体または前記実体の単一のターゲット組合せを取得することができる。たとえば、これは、選択の３つの段階、すなわち、ポアソン統計（後述）によるカプセル化、接合部での選別、および分注時点における選別／選択で達成されるものとしてよく、各々、たとえば、９０％を超える選択による。類似の仕方で、この方法の実施形態は、大きな集団から非常に希なターゲット液滴を抽出することを円滑にする。
（【００１１】以降は省略されています）

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