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公開番号2025036429
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-14
出願番号2024207359,2022145694
出願日2024-11-28,2016-11-11
発明の名称プロテアーゼ活性化受容体2のモジュレーター
出願人オアシスファーマシューティカルズ, エルエルシー,OASIS PHARMACEUTICALS, LLC
代理人個人
主分類C07K 7/08 20060101AFI20250306BHJP(有機化学)
要約【課題】本明細書において提供されるのは、野生型プロテアーゼ活性化受容体2(PAR2)の変異フラグメントを含むペプチドである。
【解決手段】
疎水性部分を含むペプチドは、細胞膜を透過してPAR2のアンタゴニストとして作用することができる。また本明細書において提供されるのは、当該ペプチドを含む組成物および細胞、ならびに当該ペプチドを使用する方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の配列：
Ｘ
４
Ｘ
５
Ｘ
６
Ｘ
７
Ｘ
８
Ｘ
９
Ｘ
１０
Ｘ
１１
Ｘ
１２
Ｘ
１３
Ｘ
１４
Ｘ
１５
Ｘ
１６
Ｘ
１７
Ｘ
１８
Ｘ
１９
Ｘ
２０
（配列番号４２）、
ここで：
Ｘ
４
は、不在、Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＮ末端リンカーであり；
Ｘ
５
は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ノルロイシン（Ｊ）、メチオニンスルホキシド（Ｍ（ＳＯ））、またはメチオニンスルホン（Ｍ（ＳＯ
２
））、またはＸ
４
が不在である場合は不在であり；
Ｘ
６
は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、またはＸ
４
～Ｘ
５
が不在である場合は不在であり；
Ｘ
７
は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、またはＸ
４
～Ｘ
６
が不在である場合は不在であり；
Ｘ
８
は、Ｎ、Ｄ、またはＥであり；
Ｘ
９
は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ
１０
は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ
１１
は、任意のアミノ酸もしくはそのＤ－アミノ酸、２－アミノイソ酪酸（Ｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、Ｐ、プロリン相同体、Ｇ、または硬化剤／ヘリックス破壊剤部分であり；
Ｘ
１２
は、Ｋ、Ｒ、Ｐ、または不在であり；
Ｘ
１３
は、任意のアミノ酸またはシトルリン（Ｃｉｔ）であり；
Ｘ
１４
は、Ｋ、またはＸ
１３
とＸ
１４
との間のペプチド結合を切断不可能にする任意のアミノ酸、または正の電荷を減少させる任意のアミノ酸であり；
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
Ｘ
９
が、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、およびＫであり；Ｘ
１０
が、ＥまたはＤであり；およびＸ
１８
が、Ｋ、Ｉ、またはＦである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
以下の配列：
Ｘ
４
Ｘ
５
Ｘ
６
Ｘ
７
Ｘ
８
ＳＥＸ
１１
Ｘ
１２
Ｘ
１３
Ｘ
１４
Ｘ
１５
Ｘ
１６
Ｘ
１７
ＫＸ
１９
（配列番号４３）、
ここで：
Ｘ
４
は、不在、Ａ、Ｇ、Ｐ、またはＮ末端リンカーであり；
Ｘ
５
は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ノルロイシン（Ｊ）、メチオニンスルホキシド（Ｍ（ＳＯ））、またはメチオニンスルホン（Ｍ（ＳＯ
２
））、またはＸ
４
が不在である場合は不在であり；
Ｘ
６
は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、またはＸ
４
～Ｘ
５
が不在である場合は不在であり；
Ｘ
７
は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、またはＸ
４
～Ｘ
６
が不在である場合は不在であり；
Ｘ
８
は、Ｎ、Ｄ、またはＥであり；
Ｘ
１１
は、任意のアミノ酸もしくはそのＤ－アミノ酸、２－アミノイソ酪酸（Ｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、Ｐ、プロリン相同体、Ｇ、または硬化剤／ヘリックス破壊剤部分であり；
Ｘ
１２
は、Ｋ、Ｒ、Ｐ、または不在であり；
Ｘ
１３
は、任意のアミノ酸またはシトルリン（Ｃｉｔ）であり；
Ｘ
１４
は、ＫまたはＸ
１３
とＸ
１４
との間のペプチド結合を切断不可能にする任意のアミノ酸、または正の電荷を減少させる任意のアミノ酸であり；
Ｘ
１５
は、任意のアミノ酸またはベータ－Ａであり；
Ｘ
１６
は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｑ、ベータ－Ａ、２－アミノイソ酪酸（Ｂ）、または不在であり；
Ｘ
１７
は、Ｉ、Ａ、ＬまたはＶであり；および
Ｘ
１９
は、疎水性アミノ酸、そのＤ－アミノ酸、または不在である、
【請求項４】
Ｘ
１３
が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはシトルリン（Ｃｉｔ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ
１３
が、Ｒである、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ
１３
が、Ｆである、請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ
１１
が、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ
１１
が、Ｋである、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｘ
１１
が、Ｐである、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ
４
が、ｅＫ、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、プロリン、またはグリシンからなる群より選択されるＮ末端リンカーである、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１１月１３日に出願された米国仮出願U.S.S.N. 62/255,334に対する35 U.S.C.§119(e)下における優先権を主張し、当該仮出願は、本明細書において参照することにより援用される。
続きを表示（約 5,600 文字）【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生学研究所－国立糖尿病消化器腎臓疾患研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）により付与された助成金番号R42DK101240下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多様なホルモン、神経伝達物質および生物学的に活性な物質は、細胞膜に位置する特異的な受容体を介して、生体の機能を制御、調節または調整する。酵母および哺乳動物を含む真核生物において、これらの受容体のうちの多くは、受容体がカップリングしているグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を活性化させることにより、細胞内シグナルの伝達を媒介する。かかる受容体は、一般に、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と称され、Ｇタンパク質連動型（G protein-linked）受容体（ＧＰＬＲ）または７回膜貫通型ドメイン受容体（ＧＰＣＲ）としても知られている。ＧＰＣＲに対する、特異的なシグナル伝達分子、すなわちリガンドの結合は、受容体の立体構造変化を引き起こし得、Ｇタンパク質に結合してこれを活性化することができる形態をもたらし、それにより、最終的に生物学的応答をもたらす細胞内イベントのカスケードの引き金を引く。典型的には、ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質と相互作用して、サイクリックＡＭＰ、イノシトールリン酸、ジアシルグリセロールおよびカルシウムイオンなどの細胞内セカンドメッセンジャーの合成を調節する。
【０００４】
既知の特徴づけられていないＧＰＣＲは、それらが多くの疾患に関連するため、薬物の作用および開発の主要な標的となっている（Jacoby et al., Chem. Med. Chem. 2006, 1:760-782）。ＧＰＣＲは、通常、３つの細胞内（ＩＬ－１／ｉ１～ＩＬ－３／ｉ３）ループおよび３つの細胞外ループ（ＥＬ－１／ｅ１～ＥＬ－３／ｅ３）により連結される７つの膜貫通ヘリックスドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）の共通の構造モチーフを共有する。７つの膜貫通ヘリックスは、細胞膜中にバレル様の空洞を形成し、リガンドとの細胞外相互作用により惹起されるこの構造における立体構造変化こそが、ドメインを細胞内でのＧタンパク質共役のためにさらに活性化する。ＧＰＣＲは、細胞の代謝、線維化、組織リモデリング、細胞の増殖および運動性、接着、炎症、神経型のシグナル伝達、ならびに凝血を制御するシグナル伝達プロセスにおいて、不可欠の役割を果たす。
【０００５】
ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質とエフェクター（Ｇタンパク質により調節される細胞内の酵素およびタンパク質、ならびにチャネル）と共に、細胞内セカンドメッセンジャーの状態を細胞外の入力に接続するモジュラーシグナル伝達系の成分である（Pierce et al., Nature Rev Mole Cell Bio 2002, 3, 639-650）。ＧＰＣＲのスーパーファミリーは大きく、ヒトゲノムのシークエンシングにより、それらをコードする８５０個の遺伝子が明らかとなっている（Hopkins and Groom Nature Reviews Drug Discovery 2002, 1, 727-730）。ＧＰＣＲは、配列相同性および機能的類似性に基づいて６つのクラスに分けることができる（Foord et al., Pharmacol Rev 2005, 57(2): 279-88）；クラスＡ（または１）（ロドプシン様）、クラスＢ（または２）（セクレチン受容体ファミリー）、クラスＣ（または３）（代謝型グルタミン酸／フェロモン）、クラスＤ（または４）（真菌の接合フェロモン受容体）、クラスＥ（または５）（サイクリックＡＭＰ受容体）、およびクラスＦ（または６）（Frizzled／Smoothened）。
【０００６】
ロドプシン様ＧＰＣＲ（クラスＡまたは１）の中には、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）があり、これは、７回膜貫通型ＧＰＣＲのサブファミリーであり、それらの細胞外ドメインの部分の切断を通して活性化され、細胞外プロテアーゼ勾配のセンサーとして作用し、細胞が、線維症、がん、凝血、ならびに無数の他のプロセス（例えば急性および慢性の炎症に関与するものなど）における組織リモデリングの間に、タンパク質分解性微小環境に対して反応することを可能にする。ＰＡＲファミリーのメンバーは、細胞外プロテアーゼ勾配のセンサーとして作用し、細胞が、組織リモデリングなどの広範な生理学的活動の間に、タンパク質分解性微小環境に反応することを可能にする。今日まで、４つの異なるＰＡＲ：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４が同定されている。それらは、ヒトの身体全体にわたり発現される。トリプシン、トロンビン、Ｘａ、ＶＩＩａ、マトリプターゼ、ヘプシン、トリプターゼおよびＭＭＰ－１などのプロテアーゼは、個々のＰＡＲメンバーのＮ末端細胞外ドメインを切断し、それにより、繋留されたリガンドをアンマスクし、これが、受容体の外表面に結合して、細胞内Ｇタンパク質への膜貫通型シグナル伝達を活性化する。ＰＡＲ１は、元々、血小板において発見されており、この特殊化されたクラスのＧＰＣＲについてのプロトタイプとして役立つ。ＰＡＲ１は、それが受容体のＮ末端細胞外ドメイン中に位置する残基Ｒ４１－Ｓ４２の間でトロンビンにより切断された場合に、活性化される。ＰＡＲ３およびＰＡＲ４もまた、トロンビンにより活性化されるが、一方、ＰＡＲ２は、トリプシン／トリプターゼ／Ｘａ／ＶＩＩａ受容体として最もよく知られている。タンパク質分解による切断は、新たなＮ末端を露出させ、これが、通常とは異なる細胞内モードにおいて、受容体の本体に結合する。ＰＡＲ（例えばＳＦＬＬＲＮ
ＰＡＲ１
（配列番号８０）、ＴＦＬＬＲＮ
ＰＡＲ１
（配列番号７１）、ＰＲＳＦＬＬＲＮ
ＰＡＲ１
（配列番号７２）、ＳＬＩＧＲＬ
ＰＡＲ２
（配列番号７３）、ＡＹＰＧＫＦ
ＰＡＲ４
（配列番号７４）の新たに切断されたＮ末端の第１の新しいアミノ酸に対応する合成ペプチドもまた、ＰＡＲに対する選択的な可溶性の分子間アゴニストとして機能することができる。
【０００７】
主要なトロンビン受容体であるＰＡＲ１は、内皮バリア機能、血管反応性（vasoreactivity）、内膜過形成、炎症、および恒常性を含む、心血管系の広範な生理学的および病理学的プロセスに影響を及ぼすことが知られている（Ossovskaya et al., Physiol Rev 2004, 84:579-621）。ＰＡＲ１は、in vitroで内皮細胞の増殖および遊走のメディエーターであり、発達中のマウスにおける血管新生のために必須である。ＰＡＲ１欠損マウスは、不完全な血管形成のために、妊娠中期（Ｅ９．５）において胎仔の半分の死亡をもたらす。驚くべきことに、ＰＡＲ１欠損マウスは、血小板機能の表現型の変化は有さず、このことが、ＰＡＲ４の発見につながった。ヒトにおける場合とは異なり、ＰＡＲ４は、マウスの血小板においては主要なトロンビン受容体であり、ＰＡＲ４欠損マウスは、トロンビンに対してシグナル応答しない。トリプシン様プロテアーゼの細胞表面受容体であるＰＡＲ２は、炎症性細胞、間葉系細胞（例えば線維芽細胞、筋線維芽細胞、平滑筋細胞）、間質細胞、内皮, 肝細胞、星状細胞、ケラチノサイト、膵細胞、神経細胞、心臓細胞、ならびに肺、腸、および肝胆道を含む上皮において広く発現される。ＰＡＲ２は、皮膚、関節、肺、脳、胃腸管および肝臓、ならびに血管系の多くの急性および慢性の炎症性疾患において重要な役割を果たし、肝臓、肺、腎臓および他の線維性疾患、アトピー性皮膚炎、慢性および急性の疼痛状態、掻痒、および肺動脈性高血圧症の進行に関連付けられている。ＰＡＲ３の機能的役割は不明であり、合成のＰＡＲ３に繋留されたリガンドＴＦＲＧＡＰ（配列番号７５）は、検出可能な下流のシグナル伝達を刺激しない。ＰＡＲはまた、機能的なホモダイマー／オリゴマー、およびヘテロダイマー／オリゴマーを形成することが示されている。ＰＡＲ１およびＰＡＲ３は、ＰＡＲ４のためのコファクターとして役立つことができ、ＰＡＲ１は、ＰＡＲ２をトランス活性化することができる（Kaneider et al., Nat. Immunol. 2007, 8:1303-12）。
【０００８】
各々のＰＡＲは、Ｇタンパク質の区別し得るサブセットにカップリングする。例えば、ＰＡＲ１は、Ｇα－サブユニットＧ
ｑ
、Ｇ
ｉ
およびＧ
１２／１３
とカップリングし、これらは、異なるプロテアーゼにより個別的に活性化される。トロンビンは、３つ全てのヘテロ三量体サブユニットを同時に活性化することができ、一方、ＭＭＰ－１は、より選択的にＧ
１２／１３
シグナル伝達を活性化する。ＰＡＲ１－Ｇ
ｑ
は、Ｃａ
２＋
を動態化するｌｎｓＰ
３
のホスホリパーゼＣ－β生成、およびタンパク質キナーゼＣ－α（ＰＫＣα）を活性化するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を刺激する。これらが次いで、ホスホリパーゼＡ
２
およびホスホリパーゼＤを活性化する。Ｇ
１２／１３
は、細胞の形状変化、遊走、およびｒｈｏ依存的な癌化において主要な役割を果たす。ＰＡＲ２は、Ｇｑ、Ｇｉおよびベータ－アレスチンシグナル伝達を刺激し得る。先に、ＰＡＲ１－ＰＡＲ２ヘテロダイマーに関してＧ
１２／１３
からＧ
ｉ
へのＧタンパク質シグナル伝達のスイッチが起こることが、内皮バリア機能の維持に関与していることが示されている。Ｇ
ｉ
は、ｒａｃ、ＰＩ３Ｋの活性化、およびアデニル酸シクラーゼの阻害およびｃＡＭＰの抑制に関与している。ＰＡＲ１およびＰＡＲ２が、どのようにしてＥＲＫ１／２などのＭＡＰキナーゼカスケードのメンバーを調節するかは、まだよく理解されていない。
【発明の概要】
【０００９】
PEPDUCINS（商標）と称される細胞浸透性ペプチドは、膜浸透性の疎水性部分を野生型ＧＰＣＲから誘導されるペプチドに付着させて、それにより、特異的な受容体－Ｇタンパク質シグナル伝達経路に対する人工のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを生成することにより考案された（Covic L. et al. 2002, PNAS 99: 643-48；米国特許第6,864,229号；同第7,696,168号；同第8,389,480号；これらの各々は、本明細書において参照することにより援用される）。これらの脂質付加されたペプチドまたはポリペプチド（「リポペプチド」）は、膜を迅速にフリッピング（flip）するかまたは越えて、高度に特異的な様式において、すなわち、アロステリックな機構によるそれらのコグネートな受容体についての高い選択性により受容体－Ｇタンパク質シグナル伝達を妨害する能力を有する。ＰＡＲ、例えばＰＡＲ１、ＰＡＲ２およびＰＡＲ４についてのリポペプチド、コレシストキニンＡおよびＢ（ＣＣＫＡ、ＣＣＫＢ）、ソマトスタチン－２（ＳＳＴＲ２）、メラノコルチン－４（ＭＣ４Ｒ）、グルカゴン様ペプチド－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）、およびＰ２Ｙ
１２
ＡＤＰ受容体が作られており、それらが由来する受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして作用する。これらの組成物は、タンパク質ファミリーＰＡＲを含む広範なＧＰＣＲの活性を活性化または阻害するために有用である。ヒトＰＡＲは、ＰＡＲ１（Genbankアクセッション番号AF019616）、ＰＡＲ２（Genbankアクセッション番号XM003671）、ＰＡＲ３（Genbankアクセッション番号NM004101）、およびＰＡＲ４（Genbankアクセッション番号NM003950.1）を含み、これらは、本明細書において参照することにより援用される。
【００１０】
PEPDUCINs（商標）は、ＰＡＲファミリーのメンバーについて顕著かつ実質的なアゴニスト効果を有しない効果的なアンタゴニストとして用いられてきたが、一方で、受容体－Ｇタンパク質共役の機構、および受容体とＧタンパク質との間の選択的な接触に対するその関与をさらに研究するため、ならびに、ＧＰＣＲが関連付けられる多様な疾患および状態の処置および／または予防のための治療剤を作るために、より効果的なＰＡＲ２アンタゴニストについての必要性がなお存在する。候補のpepducinsは、疎水性の第２のドメインを、多かれ少なかれ、ｉ３ループなどのインターフェイス接触のいずれかを担う可能性が高いＧＰＣＲセグメントと、ＴＭ６およびＴＭ５を含むその隣接領域とを含む第１のドメインに付着させること、ならびに／または、受容体中の類似のループ／ＴＭセグメントを潜在的に置き換えるかまたはこれに挿入して、それにより受容体－Ｇタンパク質シグナル伝達を修飾することにより構築される。
（【００１１】以降は省略されています）

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