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公開番号2025033387
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-13
出願番号2023139082
出願日2023-08-29
発明の名称レジオネラ属菌の検査方法
出願人アクアス株式会社
代理人弁理士法人シエル国際特許事務所
主分類C12Q 1/04 20060101AFI20250306BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】レジオネラ属菌以外の微生物、特に抗酸菌の影響を受けにくく、より正確なレジオネラ属菌の検出が可能なレジオネラ属菌の検査方法を提供する。
【解決手段】レジオネラ属菌を検査するにあたり、検体とエタンブトール又はその塩とを接触させる接触工程S1と、前記検体をレジオネラ属菌用の選択培地、又は、前記レジオネラ属菌用の選択培地に貼付したメンブレンフィルター上で培養する培養工程S2と、を少なくとも行う。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
検体とエタンブトール又はその塩とを接触させる接触工程と、
前記接触工程後の検体をレジオネラ属菌用の選択培地、又は、前記レジオネラ属菌用の選択培地に貼付したメンブレンフィルター上で培養する工程と、
を有することを特徴とするレジオネラ属菌の検査方法。
続きを表示（約 260 文字）【請求項２】
前記接触工程では、前記検体中の前記エタンブトールの濃度を０．１μｍｏｌ／ｍＬ以上４０μｍｏｌ／ｍＬ以下にすることを特徴とする請求項１に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項３】
前記検体と前記エタンブトール又はその塩との接触時間が１２時間以上であることを特徴とする請求項２に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項４】
前記検体と前記エタンブトール又はその塩との接触時間が２４時間以上１００時間以下であることを特徴とする請求項３に記載のレジオネラ属菌の検査方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養法によるレジオネラ属菌の検査方法に関する。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌は、好気性のグラム陰性桿菌であり、本来、自然界の土壌や淡水に生息する環境細菌であるが、冷却塔冷却水やプール水、温浴施設循環水等の人工水系においても高い確率で生息することが明らかとなっている。レジオネラ属菌が生息する水系のエアロゾルを吸入すると、レジオネラ属菌の気道感染が生じ、レジオネラ肺炎等のレジオネラ症を引き起こすことが知られており、日本国内では１９８１年にレジオネラ症患者が初めて報告されて以降、その患者報告数は年々増加傾向にある。
【０００３】
レジオネラ症は人から人へ感染する例は報告されていないことから、人工水系の適切な衛生管理がレジオネラ症防止手段として重要視されており、例えば浴場設備の浴槽水では、厚生労働省による「公衆浴場における水質基準等に関する指針」において、レジオネラ属菌は不検出（１０ＣＦＵ／１００ｍＬ未満）であることと定められている。レジオネラ症を防止するためには、感染源となり得る水系においてレジオネラ属菌の生息状況を正確に把握することが重要であり、レジオネラ属菌の検査には高い精度が求められている。
【０００４】
従来、温浴施設循環水等の人工水系からレジオネラ属菌を検出する方法としては、例えば、遠心分離又はメンブレンフィルターろ過により検体（試料水）を１００倍に濃縮し、その濃縮液を酸処理又は熱処理後に、レジオネラ属菌用の選択培地に塗抹して培養することでレジオネラ属菌を検出する「塗抹培養法」、及び、酸処理又は熱処理した検体をメンブレンフィルターでろ過し、そのメンブレンフィルターを選択培地に貼付して培養する「フィルター貼付法」等がある（非特許文献１参照）。これらの検査方法では、検体（試料水）をレジオネラ属菌の選択培地に塗布するか、又は、検体（試料水）をろ過したメンブレンフィルターをレジオネラ属菌の選択培地に貼付して、培養後生育してきたコロニーを目視で計数する。
【０００５】
「塗抹培養法」は、検体（試料水）の１００倍濃縮液０．１ｍＬを培地に接種するため、検出下限は１０ＣＦＵ／１００ｍＬであるが、検体（試料水）の濃縮操作及び塗抹操作でのレジオネラ属菌の回収率が低いことから、さらに高感度でレジオネラ属菌を検出するためには複数枚の培地に接種する等の作業が必要となり、検査効率低下の要因となる。また、「塗抹培養法」は、操作工程が多いため、検査者の熟練度が検査結果に影響しやすいという課題もある。
【０００６】
これに対して、「フィルター貼付法」は、検体（試料水）をろ過したメンブレンフィルターを選択培地に直接貼り付けるため、塗抹培養法ほど検査者の熟練度が要求されず、高い回収率で検査を行うことができ、また、ろ過する検体（試料水）の量を変えることにより、感度を自在に調整することができる。しかしながら、メンブレンフィルター上にはレジオネラ属菌以外の夾雑微生物が発育しやすく、それらのコロニーによりレジオネラ属菌の検出ができなくなる場合（検出不能）があり、その場合には再検査を行う等の対応が必要となる。また、レジオネラ属菌はメンブレンフィルター上にコロニーを形成し難いため、「フィルター貼付法」にはレジオネラ属菌が不検出となってしまう場合があるという課題もある。
【０００７】
前述した従来の検出方法で用いられる選択培地としては、例えば、レジオネラ属菌を培養可能な培地であるＢＣＹＥα培地に、レジオネラ属菌に対する選択性を付与するため、抗菌剤であるグリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢに加えて、抗真菌剤であるアニソマイシンを添加したＭＷＹ培地、ＢＣＹＥα培地に、抗菌剤であるグリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢに加えて、抗真菌剤であるシクロヘキシミドを添加したＧＶＰＣα培地、並びに、ＢＣＹＥα培地に、抗菌剤であるグリシン、バンコマイシン及びポリミキシンＢに加えて、抗真菌剤であるアンホテリシンＢを添加したＷＹＯα培地等があり、これらは夾雑微生物の影響をある程度排除できる選択培地として知られている。
【０００８】
また、従来、ＧＶＰ培地に、シクロヘキシミド、アンホテリシンＢ及びチアベンダゾールを添加したＣＡＴα培地を用いたレジオネラ属菌の検査方法が提案されている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に記載の選択培地を使用しても共存する微生物の影響を除ききれないことがある。これらレジオネラ属菌以外の微生物（夾雑微生物）は、一般にレジオネラ属菌よりも選択培地上でのコロニー形成及びその拡大が早いため、生育したレジオネラ属菌のコロニーを計数する際の妨げとなり、さらに、近接するレジオネラ属菌のコロニーの生育を妨げる等の障害をもたらす。
【０００９】
このため、レジオネラ属菌に対して障害を引き起こさず、かつ、夾雑微生物に対して有効な前処理と選択培地を用いて、それらの微生物の繁殖を抑制する方法が検討されてきた。夾雑微生物に対して有効な前処理方法としては、例えば、酸処理が挙げられ、検体（試料水）若しくは検体（試料水）の冷却遠心沈渣に滅菌水を加えたものにＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液を混合することにより、夾雑する細菌類の発育を抑制する方法が広く用いられている。
【００１０】
また、従来、ＨＣｌ・ＫＣｌ緩衝液の代わりに、より高い緩衝能を持つ酸性リン酸緩衝液を混合する酸処理を行う検査方法も提案されている（特許文献２参照）。さらに、夾雑微生物による汚染が激しい検体には、前処理を強化して夾雑微生物の影響を抑制する場合がある。前処理を強化する方法としては、例えば、酸処理と熱処理との併用があり、５０℃で２０分間程度処理した検体に対して前述した酸処理を行う方法等が一般的に行われている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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