特許ウォッチ

公開番号2025031377
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-07
出願番号2023137565
出願日2023-08-25
発明の名称エンジニアリングされたタンパク質
出願人株式会社キュライオ,国立大学法人東京大学,京都府公立大学法人,学校法人自治医科大学
代理人個人
主分類C12N 9/22 20060101AFI20250228BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ゲノムエンジニアリングツールとして利用可能な、エンジニアリングされたタンパク質を提供する。
【解決手段】AsCas12fのアミノ酸配列において、アミノ酸番号188位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号195位でのリシンへの置換との少なくとも一方の置換を含むタンパク質である。好ましくは、アミノ酸番号188位でのヒスチジンへの置換を少なくとも含む二重変異体、または、アミノ酸番号195位でのリシンへの置換を少なくとも含む二重変異体である。好ましくは、アミノ酸番号188位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号232位でのアラニンへの置換とを少なくとも含む三重変異体、または、アミノ酸番号195位でのリシンへの置換と、アミノ酸番号232位でのアラニンへの置換とを少なくとも含む三重変異体である。
【選択図】図1-1
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号１９５位でのリシンへの置換との少なくとも一方の置換を含む、
タンパク質。
続きを表示（約 990 文字）【請求項２】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換を少なくとも含む二重変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換とを少なくとも含む変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換とを少なくとも含む三重変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換とを含み、かつ、
アミノ酸番号１２３位でのヒスチジンへの置換、アミノ酸番号２４６位でのメチオニンへの置換、アミノ酸番号３１６でのメチオニンへの置換、またはアミノ酸番号３３７でのロイシンへの置換のうちいずれか１つの置換を含む三重変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換と、アミノ酸番号３１６位でのメチオニンへの置換とを少なくとも含む変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換と、アミノ酸番号３１６位でのメチオニンへの置換とを少なくとも含む四重変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記アミノ酸番号１８８位でのヒスチジンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換と、アミノ酸番号３１６位でのメチオニンへの置換と、アミノ酸番号４８位でのチロシンへの置換とを少なくとも含む変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記アミノ酸番号１９５位でのリシンへの置換を少なくとも含む二重変異体である、請求項１に記載のタンパク質
【請求項１０】
前記アミノ酸番号１９５位でのリシンへの置換と、アミノ酸番号２３２位でのアラニンへの置換とを少なくとも含む変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンジニアリングされた物質に関し、例えばエンジニアリングされたタンパク質に関する。
続きを表示（約 5,400 文字）【背景技術】
【０００２】
細菌及び古細菌のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、外来核酸に対する適応免疫を提供することが知られている。特許文献１には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つのクラス（クラス１及び２）と６つのタイプ（タイプＩ～ＶＩ）に分類されることが開示されている。クラス２システムには、タイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩが含まれ、Ｃａｓ９（タイプＩＩ）やＣａｓ１２（タイプＶ）などの単一のマルチドメインエフェクターＣａｓタンパク質が含まれる。
特許文献１に開示されるように、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａは、真核細胞で強力なヌクレアーゼ活性を示すことから、用途の広いゲノムエンジニアリングツールとして広く使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
国際公開第２０２２／０９２３１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｃａｓ９やＣａｓ１２等の、ゲノムエンジニアリングツールとして用いられるタンパク質には、様々な特性が要求される。
例えば、化膿連鎖球菌由来のＳｐＣａｓ９は、活性が強いという点では、ゲノムエンジニアリングツールに適している。しかし、その分子サイズは１，３６７アミノ酸残基（遺伝子が４．１ｋｂ）と大きい。一方、ＡＡＶベクターにおいては、外来遺伝子の入るスペースは４．５ｋｂ未満であり、ＳｐＣａｓ９をＡＡＶベクターに載せて動物細胞に導入することすら困難であり、ゲノムエンジニアリングツールとして用いるためには、このサイズの大きさによる制限を受ける。
従って、ゲノムエンジニアリングツールとして利用可能な、エンジニアリングされたタンパク質を提供することが求められている。
【０００５】
本発明は、上記背景の下になされたものであり、ゲノムエンジニアリングツールとして利用可能なエンジニアリングされた物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの形態は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１）アミノ酸番号１９５位（Ｄ１９５）は変異がなく、アミノ酸番号１８８位が変異され、または、２）アミノ酸番号Ｓ１８８は変異がなく、アミノ酸番号１９５位が変異したタンパク質である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ゲノムエンジニアリングツールとして利用可能な、エンジニアリングされた物質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
ＡはＡｓＣａｓ１２ｆのドメイン構造、Ｂはクライオ電子顕微鏡を用いた複合体構造解析を表す図。
ＣはＡｓＣａｓ１２ｆ－ｓｇＲＮＡ－標的ＤＮＡ三元複合体の構造モデル。
ＤはｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡの概略図。
Ａはサイズ排除クロマトグラフィーのプロファイル、ＢはＴｉｔａｎＫｒｉｏｓに記録された代表的なクライオ電子顕微鏡画像の説明図。
Ｃは単一粒子クライオ電子顕微鏡画像処理ワークフローの説明図、Ｄは３Ｄ再構成用のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）曲線を表すグラフ。
Ｅはサイズ排除クロマトグラフィーのプロファイル、ＦはＴｉｔａｎＫｒｉｏｓに記録された代表的なクライオ電子顕微鏡画像の説明図。
Ｇは単一粒子クライオ電子顕微鏡画像処理ワークフローの説明図、Ｈは３Ｄ再構成用のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）曲線を表すグラフ。
Ｉはサイズ排除クロマトグラフィーのプロファイル、ＪはＴｉｔａｎＫｒｉｏｓに記録された代表的なクライオ電子顕微鏡画像の説明図。
Ｋは単一粒子クライオ電子顕微鏡画像処理ワークフローの説明図、Ｌは３Ｄ再構成用のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）曲線を表すグラフ。
ＡはＡｓＣａｓ１２ｆとＵｎＣａｓ１２ｆの構造比較の説明図。
ＢはＡｓＣａｓ１２ｆ．１とＡｓＣａｓ１２ｆ．２の二量体界面及びｓｇＲＮＡスキャフォールドの認識サイトの説明図、ＣはＲＥＣローブに基づくＡｓＣａｓ１２ｆ．１とＡｓＣａｓ１２ｆ．２の重ね合わせの説明図。
ＤはＲＥＣ．１とＲＥＣ．２との二量体界面、ＥはＲｕｖＣ．１とＲｕｖＣ．２との二量体界面、ＦはＡｓＣａｓ１２ｆ．２によるＳｔｅｍ２の認識、ＧはＡｓＣａｓ１２ｆ．１によるＳｔｅｍ２の認識の説明図。
ＡはガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの認識サイト、ＢはＡｓＣａｓ１２ｆの静電表面ポテンシャルの説明図。
Ｃ～Ｅは、それぞれ、ステム１とＰＫ１、ステム３、およびガイドＲＮＡ－標的ＤＮＡヘテロ二重鎖の認識の説明図。
ＦはＡｓＣａｓ１２ｆのＴＳ、ＮＴＳ、ＲｕｖＣ活性部位と未培養古細菌由来のＵｎＣａｓ１２ｆとの構造比較の説明図。
ＡはＡｓＣａｓ１２ｆのＤＭＳライブラリー設計、ＢはＧＦＰ遺伝子欠失のコンテクストにおける遺伝子編集効率をゲノム評価するためのＤＭＳアプローチの概要の説明図。
Ｃは単一の突然変異がゲノム編集アクティビティに与える影響の説明図、ＤはＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＶＥＧＦ遺伝子に対するゲノム編集アクティビティを評価するためのＳｐｌｉｔ－ＧＦＰ－再構成アッセイの説明図、ＥはＡｓＣａｓ１２ｆ突然変異のゲノム編集アクティビティの説明図、Ｆはｄ２ＥＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＡｓＣａｓ１２ｆ－ＨＫＲＡとＡｓＣａｓ１２ｆによって誘導されたＧＦＰ欠失の時間的経過を表すグラフ。
ＡはＧＦＰ欠失に対する単一変異体の効果の相関を表すグラフ。
Ｂ－１はＷＴと比較して編集効率が２０％以上増加する単一アミノ酸置換のリスト。
Ｂ－２はＷＴと比較して編集効率が２０％以上増加する単一アミノ酸置換のリスト。
Ｃ、Ｄ、Ｅは、それぞれ、二重、三重、四重でのＡｓＣａｓ１２ｆ変異体のゲノム編集活性を表すグラフ。
ＡはｓｇＲＮＡ変異体のシーケンスの説明図、Ｂはフローサイトメトリーによって判定されたｓｇＲＮＡ変異体のゲノム編集アクティビティを表す説明図、Ｃは共通のシーケンスサイト（ｎ＝３は±ＳＤを意味する）用のｑＰＣＲによって定量されたｓｇＲＮＡの発現を表すグラフ、ＤはＧＦＰ欠失の時間的経過を表すグラフである。
Ｅは野生型のｓｇＲＮＡ、ＦはｓｇＲＮＡ＿ΔＳ３－５＿ｖ７の概略の説明図。
Ｇは野生型のｓｇＲＮＡスキャフォールドの構造、ＨはｓｇＲＮＡ＿ΔＳ３－５＿ｖ７スキャフォールドの構造の説明図。
Ｉは野生型のｓｇＲＮＡのＰＫ１領域、ＪはｓｇＲＮＡ＿ΔＳ３－５＿ｖ７のＰＫ１領域、Ｋは野生型のｓｇＲＮＡのＰＫ２領域、ＬはｓｇＲＮＡ＿ΔＳ３－５＿ｖ７のステム３領域の拡大図。
Ａはクライオ電子顕微鏡を用いた標的ＤＮＡ及び標的ＤＮＡ複合体結果の説明図。
ＢはＡｓＣａｓ１２ｆ－ＹＨＡＭの二量体界面、ＣはＡｓＣａｓ１２ｆ－ＹＨＡＭのターゲットＤＮＡ認識、ＤはＡｓＣａｓ１２ｆ－ＹＨＡＭの疎水性相互作用、ＥはＡｓＣａｓ１２ｆ－ＨＫＲＡのガイドＲＮＡターゲットＤＮＡヘテロ二本鎖の認識、ＦはターゲットＤＮＡの認識、ＧはｓｇＲＮＡスキャフォールドの認識の説明図。
データ収集、処理、モデル改良及び検証の結果の説明図。
データ収集、処理、モデル改良及び検証の結果の説明図。
Ａはセルフターゲッティングライブラリーの説明図、Ｂは編集頻度を表すグラフ。
Ｃ～Ｅは様々なＣａｓでのゲノム編集活性を表すグラフ。
Ａはターゲット編集効率の比較結果を表すグラフ、ＢはＰＡＭ二重鎖の認識結果の説明図。
Ｃ、Ｄは他の標的部位等におけるインデル効率を表すグラフ。
Ｅは他の標的部位等におけるインデル効率を表すグラフ。
Ａはミスマッチの影響を表すグラフ、Ｂはオフターゲット編集数の比較の説明図。
Ｃ－１はガイドシーケンスにより識別されたオフターゲットサイトの説明図。
Ｃ－２はガイドシーケンスにより識別されたオフターゲットサイトの説明図。
Ｃ－３はガイドシーケンスにより識別されたオフターゲットサイトの説明図。
筋ジストロフィーモデル人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製及び心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）への分化の説明図であり、ＡはＰＣＲによるＤＭＤエクソンの完全な欠失の確認の説明図、ＢはＤＭＤエクソン４４欠失－ｉＰＳ細胞株のゲノム配列の説明図。
筋ジストロフィーモデル人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製及び心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）への分化の説明図であり、Ｃは心筋分化１４日目のα－アクチニン－ｍＣｈｅｒｒｙのフローサイトメトリー解析の説明図、Ｄはウェスタンブロット解析を表す図。
Ｅはルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性の比較を表すグラフ、Ｆはプラスミド構築物の概略説明図、Ｇはプラスミドベクターを導入した細胞におけるルシフェラーゼ活性の増加を表すグラフ。
Ａ～Ｆは変異体を用いた治療及びノックインの説明図。
Ｇ～Ｊは変異体を用いた治療及びノックインの説明図。
Ａ～ＦはＡｓＣａｓ１２ｆ変異体を用いたＡｌｂｌｏｃｕｓにおけるＦＩＸのノックイン（マウス）の説明図。
Ｇ～ＪはＡｓＣａｓ１２ｆ変異体を用いた遺伝子転写活性化の説明図。
Ａはマウスにおける遺伝子転写活性化によるルシフェラーゼの発現を表す説明図、ＢはＲＯＩ値を表すグラフである。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓに関連して構造解析に使用した核酸配列の説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓに関連してゲノム編集に使用される核酸配列の説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓに関連してゲノム編集に使用されるプライマーとコンストラクトの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓに関連してゲノム編集に使用されるプライマーとコンストラクトの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓに関連してゲノム編集に使用されるプライマーとコンストラクトの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓに関連してゲノム編集に使用されるプライマーとコンストラクトの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
ＳＴＡＲＭｅｔｈｏｄｓにおけるキーリソースの説明図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書において、アミノ酸配列における置換変異を表す場合、元のアミノ酸の一文字表記、続いて１～３桁の数字による位置番号、次に置換されたアミノ酸の一文字表記により表現することがある。例えば、アミノ酸番号１０２２位においてアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に置換される変異が生じている場合、「Ｄ１０２２Ｎ」と表され、これは、「アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換」と同義である。アミノ酸をつないでいる-CO-NH-結合は、ペプチド結合と呼ばれる。このように結合しているアミノ酸のことをアミノ酸残基という。また、「変異」は、開始アミノ酸又は核酸配列に生じた変化を指す。この用語は、置換、挿入及び欠失が包含されることを意図するものである。また、本実施形態において、エンジニアリングされた物質はタンパク質であり、例えば、エンジニアリングされたＡｓＣａｓ１２ｆである。エンジニアリングされた物質は、例えばガイドＲＮＡやベクター等の他の物質とともに組成物として用いられてもよい。
【００１０】
細菌及び古細菌のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、外来核酸に対する適応免疫を提供し、２つのクラス（クラス１及び２）と６つのタイプ（タイプＩ～ＶＩ）に分類される。クラス２システムには、タイプＩＩ、Ｖ、及びＶＩが含まれ、Ｃａｓ９（タイプＩＩ）やＣａｓ１２（タイプＶ）などの単一のマルチドメインエフェクターＣａｓタンパク質が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの用途は、ゲノム編集に限られるわけではない。切断活性を消失させたＣａｓは、ＲＮＡ依存的なＤＮＡ結合タンパク質として機能することから、様々なエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を融合することで転写活性の調整や一塩基編集などの技術に用いられている。
ゲノム編集酵素においては標的組織への導入のためにＡＡＶなどのウイルスベクターを用いるが、搭載できる遺伝子の大きさに限界があり、Ｃａｓ９やＣａｓ１２ａはその大きさのために搭載が難しい。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許