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公開番号2025030541
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-07
出願番号2023135925
出願日2023-08-23
発明の名称ナノ粒子とタンパク質の分離および分析方法
出願人東ソー株式会社
代理人
主分類G01N 30/88 20060101AFI20250228BHJP(測定;試験)
要約【課題】
本発明の課題は、タンパク質、特に抗体医薬品およびその凝集体、懸濁状態のナノ粒子をSEC法(サイズ排除クロマトグラフィー)にて、簡便で高分離能で分離し、定量できる方法を提供するものである。
【解決手段】
粒径が10nmから150nmのサイズを有するナノ粒子と、タンパク質類とを、1以上の非イオン性界面活性剤を含む水系の溶離液にて分析することを特徴とする、サイズ排除クロマトグラフィーを提供する。
【選択図】図11
特許請求の範囲【請求項１】
粒径が１０ｎｍから１５０ｎｍのサイズを有するナノ粒子と、タンパク質類とを、
１以上の非イオン性界面活性剤を含む水系の溶離液にて分析することを特徴とする、
サイズ排除クロマトグラフィー。
続きを表示（約 890 文字）【請求項２】
前記溶離液の組成として、
前記非イオン性界面活性剤の濃度が０．０２～２％であることを特徴とする、
請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィー。
【請求項３】
前記非イオン性界面活性剤は２２０ｎｍから３８０ｎｍの紫外吸収領域において、吸収を有しないことを特徴とする、
請求項１又は２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー。
【請求項４】
前記非イオン性界面活性剤が、
以下の種類の非イオン性界面活性剤から１以上選択されることを特徴とする、
請求項１又は２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー。
１）高級アルコールエチレンオキシド付加物
２）ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（脂肪酸エチレンオキシド付加物、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル）
３）高級アルキルアミンエチレンオキシド付加物
４）脂肪酸アミドエチレンオキシド付加物（ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド）
５）ポリプロピレングリコールエチレンオキシド付加物（プルロニック（登録商標）型非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）
６）グリセリン脂肪酸エステル
７）ペンタエリスリトール脂肪酸エステル
８）ソルビトール脂肪酸エステル
９）ソルビタン脂肪酸エステル
１０）しょ糖脂肪酸エステル
１１）アルキルポリグリコシド
１２）脂肪酸アルカノールアミド
【請求項５】
前記非イオン性界面活性剤として少なくとも、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを含有することを特徴とする、
請求項１又は２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー。
【請求項６】
前記サイズ排除クロマトグラフィーのゲル基材が、シリカベースまたはポリアクリレート樹脂ベースであることを特徴とする、
請求項１又は２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、水系溶離液にて、懸濁しているナノ粒子と、溶解しているタンパク質を同一条件にて分離および分析する方法に関する。
続きを表示（約 2,000 文字）【背景技術】
【０００２】
ＧＰＣ法（ＧｅｌＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ゲル浸透クロマトグラフィー）は、ＳＥＣ法（ＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；サイズ排除クロマトグラフィー）、またはＧＦＣ法（ＧｅｌＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ゲルろ過クロマトグラフィー）とも呼ばれている液体クロマトグラフィーの１つモードであり、ポリマーの分子量測定法として、最も広く用いられている方法である。ＳＥＣ法は、多孔質充填剤を詰めたカラム中における、充填剤表面の細孔とポリマーとの「サイズ排除」（ＳｉｚｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎ）機構を原理としている。ＧＰＣ法（ＳＥＣ法）の原理（サイズ排除機構）は、一般的に次のようなモデルで説明される。
【０００３】
図３に示すように、大きなサイズのポリマーは、多孔質充填剤の深部へは到達できないため、結果的に短い流路を通り、最も早く出口に達し、小さなポリマーほど深部へ到達できるため、流路が長くなり、カラム出口に到達するのが遅くなる。この原理により、分子サイズの大きな成分から順次溶出することになる（図７参照）。一定の分子量範囲で、溶出時間と分子量の対数が直線関係になり、充てん剤の細孔よりも大きな分子は，一様に素通りされ（排除限界）、逆にあるサイズよりも小さい分子は細孔内に完全に浸透しきってしまうため、ほぼ同じ位置に溶出する（浸透限界）（図７ａ参照）。
【０００４】
そのため、測定可能な分子量範囲の試料では、なだらかな分布を持つピーク形状となることが多い。しかしながら、排除限界を超える分子量成分を含んだ試料では、この領域の成分がほぼ同じ溶出時間に溶出するため、高分子側が急激に立ち上がるピーク形状となることが多い（図７ｂ参照）。
【０００５】
液体クロマトグラフィーでは、基本的には試料は溶離液に溶解していることが必要である。ＳＥＣ法でも同様であり、ポリマーはテトラヒドロフラン等の溶媒に溶解させ、不溶物がある場合は、０．１～０．２μｍのメンブランフィルタ等で濾過してから分析に供する。ＳＥＣ法で用いられる検出器は、その用途に応じて選択される。最も使用される検出器は「屈折計」である。これは、測定されるポリマーに紫外／可視光領域で吸収を持たないものが多く、また、この検出器が「濃度計」であることが理由である。このほか、絶対分子量を算出したい場合は、「屈折計」と「光散乱検出器」や「粘度計」を合わせて使用することもある。また、測定されるポリマーに紫外／可視光領域がある場合は、「屈折計」と「紫外／可視検出器」を合わせて使用することもある。
【０００６】
近年、バイオ医薬品（抗体医薬品）の有効性／有用性が認識されるようになってきているが、一方で、その副作用については十分な研究がなされておらず、特に凝集体に関しても注目を浴びている。これら凝集体はその大きさにより、区分されることが多い。１００ｎｍ（０．１μｍ）以下のナノメートル粒子、０．１～１μｍのサブミクロン粒子、１～１０μｍのミクロン粒子等に区分される。その分析方法（粒径サイズ、濃度、個数等）は、各領域で推奨される方法が例示されている。最も小さい１００ｎｍ（０．１μｍ）以下のナノメートル粒子は、ＳＥＣ法が中心的に利用される。但し、ＳＥＣ法は分離が不十分であったり、数１００ｎｍ以上の大きな凝集体はカラムを通過することが難しいという課題もある。
【０００７】
図８はナノ粒子をＳＥＣ法にて分離する際の検量線を模式的に示した図である。一般的なＳＥＣ法と同様に一定の粒径の範囲で、溶出時間と粒径の対数は直線関係が得られる。しかしながら、一定以上大きなナノメートル粒子は、充填剤、カラムのエンドフィッティング、ラインフィルターなどを通過できないため、溶出しない。そのため、一般的なＳＥＣ法とは異なり、この領域ではピークは観測されなくなる。
【０００８】
ＳＥＣ法では、分子量が既知で分布の狭い標準試料を複数使用して、その溶出時間と分子量の対数の検量線を作製し、未知試料の分子量を算出する。
【０００９】
一般的に抗体医薬品を含むタンパク質等の分子量測定の場合、分子量既知のタンパク質分子量マーカーにて検量線を作製する。
【００１０】
ナノ粒子の検量線作製の場合は、一般的には粒形が分布の少ない複数の「ポリスチレンナノ粒子（以下ＰＳとも称す。）」が用いられることが多い。しかしながら、溶解している前記タンパク質と、懸濁状態の「ポリスチレンナノ粒子」を同時に、同一条件で分子排除クロマトグラフィーにて測定することは困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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