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公開番号2025023090
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-14
出願番号2024207668,2023575235
出願日2024-11-28,2023-01-13
発明の名称改変された組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)結合性タンパク質及び感染能に基づくAAVの分析方法
出願人東ソー株式会社
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 14/46 20060101AFI20250206BHJP(有機化学)
要約【課題】アデノ随伴ウイルス(AAV)への結合活性が向上した、改良AAV結合性タンパク質、および試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス(AAV)を感染能の違いに基づき分析する方法を提供すること。
【解決手段】KIAA0319L(UniProt No.Q8IZA0)の細胞外領域ドメイン1(PKD1)およびドメイン2(PKD2)に相当する領域中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、前記課題を解決する。不溶性担体と当該担体に固定化したKIAA0319Lの細胞外領域ドメイン1またはドメイン2に相当するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドとを含む吸着剤に試料中に含まれるAAVを吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したAAVを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、AAVの分析方法により、前記課題を解決する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の
配列番号１の３１７番目のバリンがアスパラギン酸に置換
配列番号１の３４２番目のチロシンがセリンに置換
配列番号１の３６２番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の３７１番目のリジンがアスパラギンに置換
配列番号１の３８１番目のバリンがアラニンに置換
配列番号１の３８２番目のイソロイシンがバリンに置換
配列番号１の３９０番目のグリシンがセリンに置換
配列番号１の３９９番目のリジンがグルタミン酸に置換
配列番号１の４７６番目のセリンがアルギニンに置換
配列番号１の４８７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
の全てのアミノ酸置換が生じており、かつ
以下の（１）から（５）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換
（２）配列番号１の３３０番目のアラニンがシステイン、フェニルアラニン、ロイシン、アルギニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換
（３）配列番号１の３３１番目のチロシンがシステインに置換
（４）配列番号１の３３２番目のバリンがトリプトファンまたはチロシンに置換
（５）配列番号１の３３３番目のロイシンがシステインに置換。
続きを表示（約 3,500 文字）【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において以下の（１）のアミノ酸置換が少なくとも生じている、請求項１に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号１の３３０番目のアラニンがバリンに置換。
【請求項３】
配列番号１５から２５、５４から６３、６５、８３、８５、８７、８８ならびに９０から９２のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質。
【請求項４】
請求項２に記載のＡＡＶ結合性タンパク質にさらに以下の（Ｉ）から（ＣＸＶＩＩＩ）のアミノ酸置換又はアミノ酸置換の組み合わせのいずれか１つが生じた、ＡＡＶ結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１の３１３番目のアラニンをバリンに置換
（ＩＩ）配列番号１の３３４番目のグルタミンをロイシンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３４１番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＩＶ）配列番号１の３５９番目のメチオニンをイソロイシンに置換
（Ｖ）配列番号１の３６６番目のイソロイシンをスレオニン置換
（ＶＩ）配列番号１の３６７番目のロイシンをバリンに置換
（ＶＩＩ）配列番号１の３６９番目のロイシンをグルタミンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の３７９番目のフェニルアラニンをチロシンに置換
（ＩＸ）配列番号１の３８０番目のリジンをアスパラギンに置換
（Ｘ）配列番号１の３９４番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３９８番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＩＩ）配列番号１の４０４番目のリジンをアラニンに置換
（ＸＩＩＩ）配列番号１の４１９番目のイソロイシンをフェニルアラニンに置換
（ＸＩＶ）配列番号１の４４０番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＶ）配列番号１の４４６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換
（ＸＶＩ）配列番号１の４４８番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＶＩＩ）配列番号１の４５３番目のグルタミン酸をリジンに置換
（ＸＶＩＩＩ）配列番号１の４６４番目のリジンをアスパラギンに置換
（ＸＩＸ）配列番号１の４６４番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＸ）配列番号１の４７２番目のアスパラギンをチロシンに置換
（ＸＸＩ）配列番号１の４７８番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＸＸＩＩ）配列番号１の４８０番目のバリンをアスパラギン酸に置換
（ＸＸＩＩＩ）配列番号１の３１８番目のグルタミンをアルギニンに置換および配列番号１の４２０番目のセリンをスレオニンに置換
（ＸＸＩＶ）配列番号１の３２８番目のロイシンをグルタミンに置換および配列番号１の３４３番目のスレオニンをプロリンに置換
（ＸＸＶ）配列番号１の３３２番目のバリンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４１２番目のバリンをイソロイシンに置換
（ＸＸＶＩ）配列番号１の３３２番目のバリンをアラニンに置換および配列番号１の４７３番目のチロシンをヒスチジンに置換
（ＸＸＶＩＩ）配列番号１の３３４番目のグルタミンをヒスチジンに置換および配列番号１の４７６番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の３４０番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換および配列番号１の３６９番目のロイシンをグルタミンに置換
（ＸＸＩＸ）配列番号１の３５０番目のスレオニンをアラニンに置換および配列番号１の４７６番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＸＸ）配列番号１の３５９番目のメチオニンをロイシンに置換および配列番号１の４２５番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＸＸＩ）配列番号１の３７６番目のロイシンをプロリンに置換および配列番号１の４８８番目のセリンをスレオニンに置換
（ＸＸＸＩＩ）配列番号１の３８０番目のリジンをアルギニンに置換および配列番号１の３８９番目のヒスチジンをロイシンに置換
（ＸＸＸＩＩＩ）配列番号１の３８２番目のイソロイシンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４９６番目のアスパラギンをチロシンに置換
（ＸＸＸＩＶ）配列番号１の３８４番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の４７９番目のバリンをアラニンに置換
（ＸＸＸＶ）配列番号１の３８９番目のヒスチジンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４５５番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＸＸＶＩ）配列番号１の３９５番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換および配列番号１の４３０番目のグリシンをアラニンに置換
（ＸＸＸＶＩＩ）配列番号１の３９６番目のバリンをグリシンに置換および配列番号１の４１１番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（ＸＸＸＶＩＩＩ）配列番号１の４０９番目のイソロイシンをアスパラギンに置換および配列番号１の４２８番目のイソロイシンをバリンに置換
（ＸＸＸＩＸ）配列番号１の４１６番目のフェニルアラニンをセリンに置換および配列番号１の４３４番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＸＬ）配列番号１の４２３番目のスレオニンをアラニンに置換および配列番号１の４８０番目のバリンをアスパラギン酸に置換
（ＸＬＩ）配列番号１の４４８番目のリジンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４７８番目のスレオニンをアラニンに置換
（ＸＬＩＩ）配列番号１の４８４番目のグリシンをセリンに置換および配列番号１の４８６番目のスレオニンをセリンに置換
（ＸＬＩＩＩ）配列番号１の３１２番目のセリンをプロリンに置換、配列番号１の３２９番目のアスパラギンをチロシンに置換および配列番号１の４６９番目のバリンをグルタミン酸に置換
（ＸＬＩＶ）配列番号１の３１５番目のグルタミン酸をグリシンに置換、配列番号１の４１１番目のイソロイシンをロイシンに置換および配列番号１の４４８番目のリジンをアスパラギンに置換
（ＸＬＶ）配列番号１の３２４番目のアスパラギンをヒスチジンに置換、配列番号１の３３５番目のグルタミン酸をバリンに置換および配列番号１の４６４番目のリジンをグルタミン酸に置換
（ＸＬＶＩ）配列番号１の３２６番目のバリンをグルタミン酸に置換、配列番号１の４０３番目のアルギニンをセリンに置換および配列番号１の４２５番目のセリンをグリシンに置換
（ＸＬＶＩＩ）配列番号１の３２７番目のグルタミンをロイシンに置換、配列番号１の３３８番目のリジンをグルタミン酸に置換および配列番号１の４５１番目のロイシンをイソロイシンに置換
（ＸＬＶＩＩＩ）配列番号１の３２８番目のロイシンをアルギニンに置換、配列番号１の３６０番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換および配列番号１の４０３番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（ＸＬＩＸ）配列番号１の３４３番目のスレオニンをアラニンに置換、配列番号１の３４５番目のアスパラギン酸をグリシンに置換および配列番号１の３９４番目のバリンをアスパラギン酸に置換
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養することによりＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項９】
不溶性担体と、当該担体に固定化した請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤。
【請求項１０】
請求項９に記載のＡＡＶ吸着剤を含むカラム。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ：ＡＡＶ）に結合性を有するタンパク質及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の分析方法に関する。より詳しくは、本発明は、ＡＡＶへの結合活性が向上した、改良ＡＡＶ結合性タンパク質及び試料中に含まれるＡＡＶを感染能の強さに基づき分析する方法に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【０００３】
自然界でのＡＡＶは自立性の増殖能を欠き、複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに依存する。前記ヘルパーウイルスが存在すると、ＡＡＶゲノムは宿主細胞内で複製され、ＡＡＶゲノムを含む完全なＡＡＶ粒子が形成され、宿主細胞からＡＡＶ粒子が放出される。一方、前記ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶゲノムはエピソームに維持された状態または宿主染色体に組込まれた状態（潜伏状態）となる。
【０００４】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【０００５】
ＡＡＶのうち特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、細胞への感染能の強さに違いが生じることが報告されている（非特許文献１）。したがって、ＡＡＶを遺伝子導入用のベクターとして用いる際は、前記感染能の強さの違いを迅速かつ簡便に分析する必要がある。
【０００６】
遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単に「ＡＡＶベクター」とも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。
【０００７】
ＡＡＶ産生細胞からＡＡＶベクターを回収精製する方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いた、ＡＡＶとの結合親和性に基づくアフィニティークロマトグラフィによる方法があり、夾雑物質が共存したＡＡＶベクターを含む溶液から当該ベクターを回収精製できる。具体例として、特許文献１には、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）を含み、ただしこれらドメイン中の特定位置にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上したポリペプチドを、不溶性担体に固定化するＡＡＶ結合性タンパク質（以下、単に「リガンドタンパク質」とも表記）として用いることで、ＡＡＶベクターの高純度な精製を実現している。
【０００８】
ＡＡＶのうち特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、細胞への感染能の強さに違いが生じることが報告されている（非特許文献１）。したがって、ＡＡＶを遺伝子導入用のベクターとして用いる際は、前記感染能の強さの違いを迅速かつ簡便に分析する必要がある。しかしながら、従来の分析方法は、非特許文献１でも開示しているように、培養細胞を用いた方法であり、多くの時間と労力を要した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【非特許文献】
【００１０】
Ｌｏｃｈｒｉｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ，８０（２），８２１，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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