特許ウォッチ

公開番号2025020238
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-12
出願番号2024190195,2022184277
出願日2024-10-30,2016-12-09
発明の名称RSV Fタンパク質突然変異体
出願人ファイザー・インク
代理人個人,個人,個人
主分類C07K 14/135 20060101AFI20250204BHJP(有機化学)
要約【課題】対応する未変性RSV Fタンパク質と比較して増強した免疫原性または向上した融合前形態の安定性などの、向上した特性を有するRSV Fタンパク質に由来する免疫源、およびこのような免疫原を含む組成物を提供する。
【解決手段】RSV Fタンパク質突然変異体、RSV Fタンパク質突然変異体をコードする核酸またはベクター、RSV Fタンパク質突然変異体または核酸を含む組成物、ならびにRSV Fタンパク質突然変異体、核酸またはベクター、および組成物の使用が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｆ１ポリペプチドおよびＦ２ポリペプチドを含み、野生型ＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、野生型ＲＳＶＦタンパク質の突然変異体であって、アミノ酸突然変異が、
（１）操作されたジスルフィド結合突然変異、
（２）間隙充填突然変異、
（３）静電気的突然変異、
（４）少なくとも１つの操作されたジスルフィド突然変異および少なくとも１つの間隙充填突然変異の組合せ、
（５）少なくとも１つの操作されたジスルフィド突然変異および少なくとも１つの静電気的突然変異の組合せ、
（６）少なくとも１つの間隙充填突然変異および少なくとも１つの静電気的突然変異の組合せ、ならびに
（７）少なくとも１つの操作されたジスルフィド突然変異、少なくとも１つの間隙充填突然変異、および少なくとも１つの静電気的突然変異の組合せ
からなる群から選択される、突然変異体。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３８７，２７０号および２０１６年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／４２１、１８４号に対する優先権を主張する。前述の各出願の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 4,300 文字）【０００２】
本発明は、全体としてワクチンに、具体的には呼吸器合胞体ウイルスに対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
呼吸器合胞体ウイルス、またはＲＳＶは、肺および気道に感染する呼吸器ウイルスである。ＲＳＶは、世界中の乳児における重篤なウイルス性下気道疾患の主な原因であり、高齢者における呼吸器疾患の重要な原因である。しかし、ＲＳＶ感染を予防するためのワクチンは承認されていない。
【０００４】
ＲＳＶは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。そのゲノムは、９つの構造タンパク質（３つの糖タンパク質および６つの内部タンパク質）および２つの非構造タンパク質を含む１１個のタンパク質をコードする、一本鎖のネガティブセンスＲＮＡ分子からなる。構造タンパク質は、３つの膜貫通表面糖タンパク質：付着タンパク質Ｇ、融合タンパク質Ｆ、および低分子疎水性ＳＨタンパク質を含む。ＲＳＶには２つのサブタイプ、ＡおよびＢがある。これらはＧ糖タンパク質が主に異なるが、Ｆ糖タンパク質の配列は、２つのサブタイプ間で、より保存されている。
【０００５】
成熟Ｆ糖タンパク質は、３つの一般ドメイン：細胞外ドメイン（ＥＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞質尾部（ＣＴ）を有する。ＣＴは、単一のパルミトイル化されたシステイン残基を含有する。
【０００６】
ヒトＲＳＶのＦ糖タンパク質は、Ｎ末端にシグナルペプチド配列（アミノ酸１～２５）を含有する、５７４アミノ酸からなる単一のポリペプチド前駆体（「Ｆ０」または「Ｆ０前駆体」と呼ぶ）として、ｍＲＮＡから最初に翻訳される。翻訳の際、シグナルペプチドは、小胞体内でシグナルペプチダーゼによって除去される。Ｆ０前駆体の残りの部分（すなわち、残基２６～５７４）は、２つの多塩基部位（アミノ酸１０９／１１０および１３６／１３７）で細胞プロテアーゼ（特に、フーリン）によってさらに切断され得、ｐｅｐ２７と呼ばれる２７アミノ酸からなる介在配列（アミノ酸１１０～１３６）を除去し、Ｆ１（Ｃ末端部分、アミノ酸１３７～５７４）およびＦ２（Ｎ末端部分、アミノ酸２６～１０９）と呼ばれる２つの連結した断片を生じさせる。Ｆ１は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを含有し、また２つの７残基反復領域（ＨＲＡおよびＨＲＢ）を含有する。ＨＲＡは融合ペプチドのそばにあり、ＨＲＢはＴＭドメインのそばにある。Ｆ１およびＦ２断片は、２つのジスルフィド結合を介して互いに連結している。シグナルペプチド配列を有さない未切断のＦ０タンパク質またはＦ１－Ｆ２ヘテロ二量体のいずれかは、ＲＳＶＦプロトマーを形成し得る。３つのこのようなプロトマーは組み合わさって最終的なＲＳＶＦタンパク質複合体を形成し、これは３つのプロトマーのホモ三量体である。
【０００７】
サブタイプＡおよびＢのＦタンパク質は、アミノ酸配列が約９０パーセント同一である。ＡサブタイプのＦ０前駆体ポリペプチドの配列の例を配列番号１で示し（Ａ２株、ＧｅｎＢａｎｋＧＩ：１３８２５１、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ０３４２０）、ＢサブタイプのＦ０前駆体ポリペプチドの配列の例を配列番号２で示す（１８５３７株、ＧｅｎＢａｎｋＧＩ：１３８２５０、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ１３８４３）。配列番号１および配列番号２は共に、５７４アミノ酸の配列である。配列番号１および配列番号２のシグナルペプチド配列もまた、アミノ酸１～２５として報告されている（ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔ）。両配列において、ＴＭドメインは、およそアミノ酸５３０から５５０であるが、５２５～５４８という報告もある。細胞質尾部は、アミノ酸５４８または５５０で開始し、アミノ酸５７４で終わり、パルミトイル化されたシステイン残基は、アミノ酸５５０に位置する。
【０００８】
ＲＳＶサブユニットワクチンのために調査された主要な抗原の１つはＦタンパク質である。ＲＳＶＦタンパク質三量体は、ビリオン膜と宿主細胞膜との間の融合を媒介し、また、シンシチウムの形成を促進する。宿主細胞の膜と融合する前のビリオンにおいて、Ｆ分子の最大の集団は、ＴＭドメインがウイルスエンベロープ内に固定された、ロリポップ形状の構造を形成する［Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｇｒａｎｄｉ，Ｇ．、Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、１０、８０７、２０１２］。この立体構造は、融合前立体構造と呼ばれる。融合前ＲＳＶＦは、オリゴマーの状態の間を区別することなく、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｄ２５、ＡＭ２２、およびＭＰＥ８によって認識される。融合前Ｆ三量体は、ｍＡｂＡＭ１４によって特異的に認識される［ＧｉｌｍａｎＭＳ、ＭｏｉｎＳＭ、ＭａｓＶら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｔｈａｔｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓａｑｕａｔｅｒｎａｒｙ，ｃｌｅａｖａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｐｉｔｏｐｅｏｎｔｈｅＲＳＶｆｕｓｉｏｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓ、１１（７）、２０１５］。ＲＳＶが細胞内に侵入する間、Ｆタンパク質は、融合前状態（本明細書において「融合前Ｆ」と呼ばれ得る）から、中間体の広がった構造を介して、融合後状態（「融合後Ｆ」）に再編成される。この再編成の間、融合前分子のＣ末端コイルドコイルは、その３つの構成要素鎖に解離し、これは次いで、球状頭部の周りを包み、３つのさらなるへリックスと合わさって、融合後の６ヘリックスバンドルを形成する。融合前ＲＳＶＦ三量体は、温度の上昇などの苛酷さが次第に増す化学的または物理的条件に置かれると、構造的変化を起こす。まず、三量体構造が失われ（分子内で少なくとも局所的に）、次いで、融合後形態に再編成され、次いで、ドメインが変性する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ウイルスの侵入を防ぐために、Ｆ特異的な中和抗体は、ウイルスエンベロープが細胞膜と融合する前に、おそらく、ビリオン上のＦの融合前立体構造、または場合によっては広がった中間体上に結合しなくてはならない。したがって、融合前形態のＦタンパク質は、所望のワクチン抗原として好ましい立体構造であると見なされる［Ｎｇｗｕｔａ，Ｊ．Ｏ．、Ｃｈｅｎ，Ｍ．、Ｍｏｄｊａｒｒａｄ，Ｋ．、Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｇ．、Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｙａｓｓｉｎｅ，Ｈ．Ｍ．、Ｍｏｉｎ，Ｓ．Ｍ．、Ｋｉｌｌｉｋｅｌｌｙ，Ａ．Ｍ．、Ｃｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｄｒｕｚ，Ａ．、Ｇｅｏｒｇｉｅｖ，Ｉ．Ｓ．、Ｒｕｎｄｌｅｔ，Ｅ．Ｊ．、Ｓａｓｔｒｙ，Ｍ．、Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｂ．、Ｙａｎｇ．Ｙ．、Ｚｈａｎｇ，Ｂ．、Ｎａｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．、Ｃａｐｅｌｌａ，Ｃ．、Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｍ．、Ｌｅｄｇｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｃｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｋｗｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．、Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．、ＳｃｉｅｎｃｅＴｒａｎｓｌａｔ．Ｍｅｄ．、１４、７、３０９（２０１５）］。トリトンＸ－１００、トリトンＸ－１１４、ＮＰ－４０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどの界面活性剤での膜からの抽出、または細胞外ドメインとしての発現、物理的もしくは化学的ストレス、または保存の際に、Ｆ糖タンパク質は融合後形態に容易に変換される［ＭｃＬｅｌｌａｎＪＳ、ＣｈｅｎＭ、ＬｅｕｎｇＳらＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＲＳＶｆｕｓｉｏｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｔｒｉｍｅｒｂｏｕｎｄｔｏａｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３４０、１１１３～１１１７（２０１３）；Ｃｈａｉｗａｔｐｏｎｇｓａｋｏｒｎ，Ｓ．、Ｅｐａｎｄ，Ｒ．Ｆ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．、ＥｐａｎｄＲ．Ｍ．、Ｐｅｅｐｌｅｓ，Ｍ．Ｅ．、ＪＶｉｒｏｌ．８５（８）：３９６８～７７（２０１１）；Ｙｕｎｕｓ，Ａ．Ｓ．、ＪａｃｋｓｏｎＴ．Ｐ．、Ｃｒｉｓａｆｉ，Ｋ．、Ｂｕｒｉｍｓｋｉ，Ｉ．、Ｋｉｌｇｏｒｅ，Ｎ．Ｒ．、Ｚｏｕｍｐｌｉｓ，Ｄ．、Ａｌｌａｗａｙ，Ｇ．Ｐ．、Ｗｉｌｄ，Ｃ．Ｔ．、Ｓａｌｚｗｅｄｅｌ，Ｋ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０年１月２０日、３９６（２）：２２６～３７］。したがって、ワクチン抗原としての融合前Ｆの調製は、依然として困難である。中和抗体および防御抗体は、ウイルスの侵入に干渉することによって機能するため、融合後特異的抗体のみを誘起するＦ抗原は、融合前特異的抗体を誘起するＦ抗原としては効果的でないと予想されるという仮説が立てられる。したがって、融合前形態（または場合によっては広がった中間体形態）のＦタンパク質免疫原を含有するＦワクチンを利用することがさらに望ましいと考えられる。これまでの試みでは、ＲＳＶワクチンの承認をサポートするために十分なレベルの保護を誘起することを臨床で実証したＲＳＶワクチンは得られていない。したがって、対応する未変性ＲＳＶＦタンパク質と比較して増強した免疫原性または向上した融合前形態の安定性などの、向上した特性を有するＲＳＶＦタンパク質に由来する免疫源、および、このような免疫原を含む組成物、例えばワクチンが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一部の態様では、本発明は、対応する野生型ＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列に対する、アミノ酸配列において導入された突然変異を呈し、かつ野生型ＲＳＶＦタンパク質に対してまたは野生型Ｆタンパク質を含むウイルスに対して免疫原性である、野生型ＲＳＶＦタンパク質の突然変異体を提供する。突然変異体におけるアミノ酸突然変異には、野生型ＲＳＶＦタンパク質に対する、アミノ酸の置換、欠失、または付加が含まれる。
（【００１１】以降は省略されています）

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