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公開番号2025020127
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-12
出願番号2024174698,2023117842
出願日2024-10-04,2018-03-28
発明の名称ネオアンチゲン特異的なT細胞受容体配列を単離する方法
出願人個人
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類A61K 35/17 20250101AFI20250204BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】哺乳類におけるがんを治療若しくは予防するための医薬の製造方法を提供する。
【解決手段】対を成すT細胞受容体(TCR)アルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離し、単離された、対を成すTCRアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分の配列をコードするヌクレオチドを、宿主細胞内に導入し、対を成すTCRアルファとベータ鎖又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を得る工程、並びに得られた細胞集団を哺乳類におけるがんを治療若しくは予防するための医薬に製剤化する工程、を含む方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
対を成すＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離する方法であって、
（ａ）生体試料から、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程；
（ｂ）単離されたＴ細胞を、変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養する工程であって、それによりＴ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；
（ｃ）共培養されたＴ細胞を分取して分離した単一のＴ細胞試料とする工程；
（ｄ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを単離する工程；
（ｅ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを配列決定する工程であって、ここで該配列決定は：
（ｉ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを増幅する工程；
（ｉｉ）増幅された該ｃＤＮＡの多様な断片を作製し、該多様な断片にタグを付す工程；
（ｉｉｉ）タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を増幅する工程；及び
（ｉｖ）増幅され、タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を配列決定する工程であって；ここで配列決定は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を同定する工程；
（ｆ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの既知の配列に対してアラインメントして、どの単一のＴ細胞試料が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞を含むかを同定する工程；
（ｇ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してアラインメントして、（ｆ）で１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、各々の分離した単一のＴ細胞試料のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、
（ｈ）（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を同定する工程；
（ｉ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数を計測する工程；
（ｊ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片を採取し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程；
（ｋ）（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を同定し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；並びに
（ｌ）（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖、及び
（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、
をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングし、
任意選択で、（ｋ）で同定された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲア
ルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第２のＴＣＲアルファ鎖、及び、
（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、
をコードする１つ以上の第２のヌクレオチド配列をアセンブリングし、
単離され、対を成すＴＣＲアルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を作製する工程、
を含む方法。
続きを表示（約 2,400 文字）【請求項２】
１つ以上のＴ細胞活性化マーカーが、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターロイキン（ＩＬ）－２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２２の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各々の分離した単一のＴ細胞試料に由来するｍＲＮＡを、各々の分離した単一のＴ細胞試料に対する異なるタグによりラベル化する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｈ）が、アルファとベータ鎖のＶセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端近傍に位置する、保存されたアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を同定することにより、ＴＣＲＣＤＲ３配列を同定する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ｋ）が、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の定常（Ｃ）領域配列と、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列を同定する工程、をさらに含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ｌ）が、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｌ）が、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程、を含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
使用者のコンピューター装置において、（ｆ）で同定された単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法であって；
ここで（ｇ）は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、（ｆ）で同定された単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベ
ータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含み；
ここで（ｈ）は、（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲＣＤＲ３配列のコンピューター化された同定を行う工程を含み；
ここで（ｉ）は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数のコンピューター化された計測を行う工程を含み；
ここで（ｊ）は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片、のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程を含み；及び
ここで（ｋ）は、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含む、
方法。
【請求項９】
対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を調製する方法であって、該方法は、
請求項１～８のいずれか１項の方法により、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を単離する工程、及び
単離された、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞内に導入し、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を発現する細胞を得る工程、
を含む方法。
【請求項１０】
対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を発現する宿主細胞の数を増大させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本特許出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願番号６２/４７９，
３９８の利益を主張するものであり、それは参照により組み込まれる。
続きを表示（約 4,100 文字）【０００２】
連邦に支援された研究と開発に関する記載
本発明はアメリカ国立衛生研究所、全米がん研究所により与えられた、プロジェクト番号ZIABC010985の下における政府支援により行われた。政府は本発明において一定の権利
を有する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書に全体として参照により組み込まれるのは、本明細書と同時に提出され、下記：２０１８年３月２２日付けの”737921 SeqListing_ST25.txt”と名付けられた１つの５，５３０バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、より同定される、コンピューター読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
がん抗原（例えばネオアンチゲン）特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝的に加工されている細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者においてポシティブな臨床応答を奏することができる。それにも関わらず、がんと他の疾患を幅広く治療するためにＴＣＲが加工された細胞を成功裏に使用するためには障害が残っている。例えばがん抗原（例えばネオアンチゲン）を特異的に認識するＴＣＲの同定及び／又は患者からの単離は困難であるかもしれない。従ってがん反応性（例えばネオアンチゲン反応性）のＴＣＲを得る改善された方法に対する需要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の１態様は、対を成すＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を単離する方法を提供し、その方法は、（ａ）生体試料から、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程；（ｂ）単離されたＴ細胞を、変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養する工程であって、それによりＴ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；（ｃ）共培養されたＴ細胞を分取（sorting）して分離した単一
のＴ細胞試料（separate single T cell）とする工程；（ｄ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを単離する工程；（ｅ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡの配列決定を行う工程であって、ここで該配列決定は：（ｉ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを増幅する工程；（ｉｉ）増幅された該ｃＤＮＡの多様な断片を作製し、該多様な断片にタグを付す工程；（ｉｉｉ）タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を増幅する工程；及び（ｉｖ）増幅され、タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を配列決定する工程であって；ここで配列決定は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を同定する工程；（ｆ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの既知の配列に対してアラインメントして、どの単一のＴ細胞試料が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞を含むかを同定する工程；（ｇ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してアラインメントして、（ｆ）で１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、各々の分離した単一のＴ細胞試料のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、（ｈ）（ｇ）で同定されたＴＣＲアル
ファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を同定する工程；（ｉ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数を計測する工程；（ｊ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片を採取し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程；（ｋ）（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を同定し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；並びに（ｌ）（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖、及び（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングし（assemble）、任意選択で、（ｋ）で同定された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第２のＴＣＲアルファ鎖、及び、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、をコードする１つ以上の第２のヌクレオチド配列をアセンブリングし、単離され、対を成すＴＣＲアルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を作製する工程を含む。
【０００６】
本発明の別の態様は、がん特異的な変異によりコードされる、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定する方法を提供し、該方法は：（ａ）使用者のコンピューター装置において、ｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程であって、ここで該ｃＤＮＡは単一のＴ細胞により、該Ｔ細胞と変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養に続いて作製されるｍＲＮＡによりコードされ、それによって該Ｔ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；（ｂ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、ｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；（ｃ）（ｂ）において同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、及び、（ｂ）において同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列のコンピューター化された同定を行う工程；（ｄ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数、のコンピューター化された計測を行う工程；（ｅ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列と異なる工程；並びに、（ｆ）（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグ
メント配列、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｅ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、を含む。
【０００７】
本発明の別の態様は、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を調製する方法を提供し、該方法は、本明細書で述べられる本発明の方法のいずれかにより、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離する工程、及び、単離された、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞内に導入し、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を発現する細胞を得る工程を含む。
【０００８】
本発明のさらなる態様は、本明細書で述べられた本発明の方法のいずれかにより単離された、一対のＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を提供する。
【０００９】
本発明のなお別の態様は、本明細書で述べられた本発明の方法のいずれかにより調製された、単離された細胞集団を提供する。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、関連する医薬組成物と、がんの治療又は予防の方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
（【００１１】以降は省略されています）

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