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公開番号2025016467
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-04
出願番号2024173246,2018561024
出願日2024-10-02,2017-04-26
発明の名称改善された薬物動態を有する、グリコシル化VWF融合タンパク質
出願人オクタファルマアクチェンゲゼルシャフト
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C07K 19/00 20060101AFI20250128BHJP(有機化学)
要約【課題】改善された薬物動態を有する、グリコシル化フォン・ヴィレブランド因子(VWF)融合タンパク質を提供する。
【解決手段】メインプロテインおよび一つ以上の延長ペプチドを含む融合タンパク質であって、メインプロテインのアミノ酸配列が、哺乳動物タンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似であり、そして、前記延長ペプチドが、O-グリコシル化アミノ酸のクラスターを含む、融合タンパク質を提供する。メインプロテインは、好ましくはVWFである。融合タンパク質は、メインプロテインと比較して、増加した半減期を有し、そして、たとえば、FVIIIのような、結合パートナーの半減期を増加させるために使用され得る。本発明はさらに、融合タンパク質によって形成される複合体、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
メインプロテインと１つ以上の延長ペプチドを含む融合タンパク質であって、メインプロテインのアミノ酸配列が、哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似であり、そして、前記延長ペプチドが、Ｏ－グリコシル化アミノ酸のクラスターを含む、融合タンパク質。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
延長ペプチドのないメインプロテインと比較して、融合タンパク質が、増加した半減期を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
１つ以上の延長ペプチドのアミノ酸配列が、前記メインプロテインまたは断片の非反復アミノ酸配列の一部（ｎｏｎ－ｒｅｐｅａｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｅｃｔｉｏｎ９と同一または類似である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
１つ以上の延長ペプチドが、絨毛性ゴナドトロピン β－サブユニット（ＣＧ－β）由来ではない、特に、ＣＧ－βのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）と同一または類似していない、請求項１から３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
延長ペプチドの、Ｏ－グリコシル化アミノ酸のクラスターが、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのＯ－グリコシル化されたアミノ酸を含有する、請求項１から４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｏ－グリコシル化部位のクラスターが、少なくとも一つのスレオニンを、Ｏ－グリコシル化アミノ酸として含み、好ましくは、前記クラスターが、スレオニンとセリンの両方を、Ｏ－グリコシル化アミノ酸として含む、請求項１から５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
１つ以上の延長ペプチドが、１０個のアミノ酸中に少なくとも１つのＯ－グリコシル化部位、好ましくは、８個のアミノ酸に少なくとも１つのＯ－グリコシル化部位を含む、請求項１から６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
１つ以上の延長ペプチドが、２０～６０個のアミノ酸、好ましくは２２～４０個のアミノ酸、より好ましくは２６～３６個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項１から７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
１つ以上の延長ペプチドが、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）のＯ－グリコシル化ペプチドに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
１つ以上の延長ペプチドが、ＶＷＦのＯ－グリコシル化されたペプチド、特に配列番号１に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、少なくとも１００％の配列同一性を有する、請求項９に記載の融合タンパク質。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、特に、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のようなヒト凝固因子の半減期（ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）の延長に関する。
続きを表示（約 2,100 文字）【背景技術】
【０００２】
血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）は、血液凝固（blood clotting）または凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を制御する身体の能力を損なう遺伝性遺伝子病の一群である。その最も一般的な形態である、血友病Ａでは、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）が不足している。血友病Ａは、５，０００～１０，０００人の男性の出生の約１人に発生する。ＦＶＩＩＩタンパク質は、多機能性を有する血液凝固における必須の補因子である。ＦＶＩＩＩの欠乏は、ＦＶＩＩＩの血漿由来濃縮物または組換え生産されたＦＶＩＩＩで治療することができる。ＦＶＩＩＩの濃縮物での処置は、血友病患者の正常化した寿命をもたらす。
【０００３】
血友病Ａの患者は、必要に応じて、または週に数回投与される予防的治療として、ＦＶＩＩＩで治療される。予防的治療のために、ＦＶＩＩＩの、１５－２５ＩＵ／ｋｇ体重が週３回投与され、それは、ＦＶＩＩＩの絶えない必要性と血液系におけるその短い半減期のために必須であり、ヒトでは、たった約１１時間である（Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎら、２００４年）。
【０００４】
血液中では、正常状態では、ＦＶＩＩＩ分子は、常に、その補因子であるフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）と結合しており、分解の様々な異なる形態から、ＦＶＩＩＩ分子を安定化する。ＦＶＩＩＩとＶＷＦの非共有結合複合体は、０．２～０．３ｎＭと高い結合親和性を有する（Ｖｌｏｔら、１９９６年）。
【０００５】
歴史的に、血友病Ａは、ヒト血漿に由来するＦＶＩＩＩで治療されてきた。しかし、１９９０年代以降、組換え生産された異なるＦＶＩＩＩタンパク質が市販された。しかし、血漿由来も、組換え生産されたＦＶＩＩＩタンパク質も、最適な薬物動態学的特性を持っていない。他の多くの治療的タンパク質と同様に、それらは、ペプチダーゼによって代謝回転（metabolic turnover）に付され、それらのｉｎｖｉｖｏでの半減期を有意に制限する。
【０００６】
Ｔｉｅｄｅら、によって検討されたように（２０１５）、ＦＶＩＩＩの半減期を延長させる試みは、Ｆｃ融合（Ｅｌｏｃｔａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａ、ｅｆｍｏｒｃｔｏｃｏｇａｌｆａ）、ポリエチレングリコールの付加（ｔｕｒｏｃｔｏｃｏｇａｌｆａｐｅｇｏｌ［Ｎ８－ＧＰ］、ＢＡＹ９４－９０２７、ＢＡＸ８５５）および短鎖の構築物（ＣＳＬ６２７）を含む。
これらの技術は全て、ＦＶＩＩＩ分子を変化させ、そして、およそ１．５倍に半減期の延長されたＦＶＩＩＩをもたらす。
【０００７】
ＦＶＩＩＩのさらなる半減期の延長は、ＶＷＦ半減期に限定される。Ｙｅｅらによって示されているように、ヒトＶＷＦＤ´Ｄ３ドメインは、血漿中のＦＶＩＩＩを安定化するのに十分である。しかし、Ｄ´Ｄ３－Ｆｃ融合タンパク質は、ＶＷＦ－／－マウスでのみ、ＦＶＩＩＩの半減期を延長することができる。血友病Ａのマウスにおいて、タンパク質断片の、ＦＶＩＩＩ結合に対する、内因性ＶＷＦとの、十分でない競争のために、Ｄ´Ｄ３－Ｆｃの構築物は、ＦＶＩＩＩの半減期を延長させない。
【０００８】
ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２は、ＶＷＦのＤ´Ｄ３ドメイン、ＩｇＧのＦｃドメインおよびＸＴＥＮを含む、ＦＶＩＩＩ構築物の半減期の延長の成功を報告する。この構築物は、内因性ＶＷＦに結合しないので、同じ半減期の延長の効果は、ＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ－ダブルノックアウト（ＤＫＯ）および血友病Ａマウスの両方に見られる。しかしながら、in vitroでは、完全に機能的であるが、in vivoでは、著しく低下した活性を示す。
【０００９】
治療用タンパク質の半減期を高めるための他のアプローチは、治療用タンパク質を、トランスフェリンおよびアルブミンのような、天然に長い半減期を有するタンパク質に、または、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）などのタンパク質ドメインに、遺伝子融合することが含まれる。
【００１０】
ＣＧは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む糖タンパク質ホルモンファミリーに属する。これらの糖ホルモンは、ヘテロ二量体であり、そして、共通のα－サブユニットと、様々な活性を与える、ユニークなβ－サブユニットからなる。ヒトＣＧ（ｈＣＧ）の半減期は、そのカウンターパートである、ＬＨ、ＦＳＨおよびＴＳＨの半減期よりも、かなり長い。ｈＣＧ－βの、Ｏ－グリコシル化ＣＴＰが、この半減期の延長に関与することが示された。ＣＴＰは、４つのＯ－グリコシル化部位（Ｓ
＊
で示される）を有する配列ＦＱＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱ、と記載されている（Ｂｉｒｋｅｎら、１９７７年）。
（【００１１】以降は省略されています）

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