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公開番号2025015730
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-30
出願番号2024200599,2022537008
出願日2024-11-18,2020-12-18
発明の名称PSMAに結合する抗原結合ドメイン
出願人オートラスリミテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 16/28 20060101AFI20250123BHJP(有機化学)
要約【課題】抗原前立腺特異的膜抗原(PSMA)に結合する抗原結合ドメイン、およびそのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
【解決手段】本発明者らは、改善された特性を有する新しいPSMA結合ドメインを同定し、特徴付けた。抗原結合ドメインは、例えば、以下のいずれかを含み得る:(a)以下から選択される重鎖可変領域(VH)、および軽鎖可変領域(VL):(i)VH-配列番号7、VL-配列番号8、(ii)VH-配列番号15、VL-配列番号16、(iii)VH-配列番号23、VL-配列番号24、および(iv)VH-配列番号31、VL-配列番号32、または(b)以下から選択されるドメイン抗体可変領域:(i)配列番号36、(ii)配列番号40、(iii)配列番号44、(iv)配列番号48、および(v)配列番号52。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
明細書に記載の発明。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する抗原結合ドメインに関する。本発明はまた、そのような抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。ＰＳＭＡに結合するＣＡＲを発現する細胞は、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および結腸癌を含む固形腫瘍などの癌性疾患の処置に有用である。
続きを表示（約 4,100 文字）【背景技術】
【０００２】
発明の背景
前立腺癌
前立腺癌は、男性において最も頻繁に診断される癌型であり、癌関連死の第２の主因であると推定されている。根治的前立腺切除術は依然として最も一般的な処置選択肢の１つであり、放射線療法または化学療法と組み合わせてもよい。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、抗体の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、Ｔ細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインに全て接続された、アミノ末端を認識する抗原、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１ａを参照のこと）。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現する場合、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのＣＡＲが開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入アプローチは、様々な癌の処置のために現在臨床試験中である。
【０００５】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）
前立腺癌を処置するための免疫療法アプローチの１つの標的は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅＩ）またはＮＡＡＧペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＭＡは、Ｎ－アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）のグルタメートおよびＮ－アセチルアスパルタートへの加水分解を触媒する８４ｋＤａのクラスＩＩ膜貫通亜鉛金属酵素である。タンパク質は主に細胞外であり、小さな細胞内領域のみを有する。
【０００６】
ＰＳＭＡは前立腺で高度に発現され、全原発性前立腺癌の９０％超で過剰発現される。健康な組織でのＰＳＭＡ発現は最小限である。したがって、ＰＳＭＡは、前立腺癌の診断および処置のための標的としての有用性を示している。さらに、ＰＳＭＡは、腎臓癌、乳癌および結腸癌における標的としての潜在的有用性を有する。
【０００７】
Ｊ５９１モノクローナル抗体に基づく抗原結合ドメインを含む抗ＰＳＭＡＣＡＲは、以前に記載されている（ＫｌｏｓｓＣＣ．ら、ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１８７月５日；２６（７）：１８５５－１８６６。）。
本発明者らは、改善された特性を有する代替ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲを作製しようと努めた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
ＫｌｏｓｓＣＣ．ら、ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１８７月５日；２６（７）：１８５５－１８６６
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計。（ａ）ＣＡＲの一般化された構造：結合ドメインは抗原を認識し、スペーサーは、結合ドメインを細胞表面から上昇させ、膜貫通ドメインはタンパク質を膜に固定し、エンドドメインはシグナルを伝達する。（ｂ）～（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および並べ替え：（ｂ）初期設計は、ＦｃεＲ１－γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介してＩＴＡＭシグナルのみを伝達し、その後の設計は、シスにおいて追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激シグナルを伝達した。
図２は、前立腺特異的膜抗原の構造。前立腺特異的膜抗原は、７５０個のアミノ酸のクラスＩＩ膜糖タンパク質である。細胞質（細胞質ゾル）ドメインは残基１～１９である。ＩＩ型膜タンパク質のシグナルアンカーは残基２０～４３である。細胞外ドメインは残基４４～７５０である。細胞外ドメインは、プロテアーゼ、頂端およびＣ末端ドメインから構成される。
図３は、キメラ抗原受容体の異なる結合ドメインフォーマット。（ａ）ＦａｂＣＡＲフォーマット、（ｂ）ｄＡｂＣＡＲフォーマット、（ｃ）ｓｃＦｖＣＡＲフォーマット
図４は、クローンファージおよびｓｃＦｖ培養物のＥＬＩＳＡアッセイ。組換えタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイでの初期スクリーニング（ｎ＝３）後の複製物中のクローンファージおよびｓｃＦｖ培養物のＥＬＩＳＡアッセイ。
図５は、特定のファージ集団の滴定および濃縮。（ａ）組換えヒトＰＳＭＡタンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）パニングのみからのパニングラウンド１および２後の特異的ファージ集団の滴定および濃縮、（ｂ）ＰＳＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞に対する１ラウンドの組換えタンパク質パニングおよび１ラウンドの細胞パニング後のファージの滴定および濃縮。
図６は、モノクローナルＣＭｙｃタグ付きｄＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング。細胞パニング後の滴定プレートからのＴＧ１コロニーによって発現されるモノクローナルＣＭｙｃタグ付きｄＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング。発現をＩＰＴＧ誘導によって行い、スクリーニングを組換えヒトＰＳＭＡに対して行った。検出を、抗ＣＭｙｃタグＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。
図７は、モノクローナルＣＭｙｃタグ付きｄＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング。高（クローン３０）ＰＳＭＡ発現または低（クローン８３）ＰＳＭＡ発現を形質導入していないまたは形質導入したＳｕｐＴ１細胞に結合する抗ＰＳＭＡｄＡｂのフローサイトメトリー分析。ｄＡｂクローンＢ８およびＧ７は、高レベルの特異的結合を示す。
図８は、図７に表されるＦｃタグ付きｄＡｂのフローサイトメトリー分析。
ＮＧＳのフローサイトメトリー分析により、ＰＳＭＡ発現細胞株に結合するｄＡｂ配列が同定された。ｄＡｂ２および２５は、適切な細胞株への高い結合を示した。
図１０は、細胞パニングおよびＮＧＳ由来ｄＡｂを使用したＰＳＭＡ発現細胞株のＩＨＣ染色。データは、ＮＧＳ由来のクローン２および２５が陽性対照（Ｊ５９１および７Ａ１２抗体）と同等の染色を示すことを示唆する。
図１０は、細胞パニングおよびＮＧＳ由来ｄＡｂを使用したＰＳＭＡ発現細胞株のＩＨＣ染色。データは、ＮＧＳ由来のクローン２および２５が陽性対照（Ｊ５９１および７Ａ１２抗体）と同等の染色を示すことを示唆する。
図１０は、細胞パニングおよびＮＧＳ由来ｄＡｂを使用したＰＳＭＡ発現細胞株のＩＨＣ染色。データは、ＮＧＳ由来のクローン２および２５が陽性対照（Ｊ５９１および７Ａ１２抗体）と同等の染色を示すことを示唆する。
図１１は、ＦＡＣＳに基づく死滅アッセイ。ヒトＰＳＭＡ抗原（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＦＢＫを２４時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
図１１は、ＦＡＣＳに基づく死滅アッセイ。ヒトＰＳＭＡ抗原（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞を標的細胞として使用した。非操作ＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）を陰性対照として使用した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＦＢＫを２４時間のインキュベーション後にアッセイし、細胞蛍光測定分析によって分析した。
図１２は、サイトカイン放出アッセイ。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびヒトＰＳＭＡ抗原を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）と陰性対照としての操作されていないＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）との共培養物から２４時間で上清を回収することによって、ＣＡＲＴ細胞によるＩＬ－２（上）およびＩＦＮγ（下）の分泌を測定した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
図１２は、サイトカイン放出アッセイ。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびヒトＰＳＭＡ抗原を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）と陰性対照としての操作されていないＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）との共培養物から２４時間で上清を回収することによって、ＣＡＲＴ細胞によるＩＬ－２（上）およびＩＦＮγ（下）の分泌を測定した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
図１２は、サイトカイン放出アッセイ。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびヒトＰＳＭＡ抗原を発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＰＳＭＡ）と陰性対照としての操作されていないＳｕｐＴ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＮＴ）との共培養物から２４時間で上清を回収することによって、ＣＡＲＴ細胞によるＩＬ－２（上）およびＩＦＮγ（下）の分泌を測定した。Ｔ細胞を標的細胞と１：１、１：４および１：８のエフェクター対標的比で共培養した。ＩＬ－２およびＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって検出した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の態様の要旨
本発明者らは、改善された特性を有する新しいＰＳＭＡ結合ドメインを同定し、特徴付けた。
（【００１１】以降は省略されています）

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